蔚 然，王良玉，高 琦，胡文娟，竇海偉，向 莉，辛德莉，郭東星△

(1．首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院/北京熱帶醫(yī)學研究所,北京100050 ；2.首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院，北京100050)

流感嗜血桿菌(Hi)為革蘭陰性菌，是人類呼吸道黏膜的常見定植細菌。流行病學調查顯示北京地區(qū)5歲以下急性呼吸道感染患兒2000-2002年呼吸道Hi攜帶率為26.1%，隨著疫苗的應用Hi攜帶率有所下降，但2010-2012年仍高達16.3%[1]。Hi是兒童時期細菌性腦膜炎、肺炎和菌血癥的重要病原菌之一，還可導致兒童中耳炎、上頜竇炎、急性會厭炎、化膿性關節(jié)炎和眼內炎等[2]，給兒童健康造成很大威脅。由于Hi毒力較強，病情變化快，其導致的小兒肺炎屬于較嚴重的一種類型，病死率沒有得到有效控制，各地的診治方法也無標準，常有漏診、誤診情況[3]。Hi的早期、快速、準確檢測，對疾病的早期治療、疾病的轉歸及預后起到非常重要的作用?，F(xiàn)有診斷方法，如分離培養(yǎng)、血清學診斷等不能滿足臨床需要，需不斷探索早期、快速診斷Hi感染的新方法。近年來，分子生物學診斷正逐漸成為研究的熱點。本研究擬建立一種SYBR-Green染料法實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測Hi感染的方法，以期實現(xiàn)Hi的臨床早期、快速、準確診斷?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集2014年9-12月就診于北京兒童醫(yī)院的患兒咽拭子標本226份。本研究通過倫理審查，患兒家屬均知情同意。菌株：肺炎支原體標準株M129菌株(ATCC29342)、人型支原體標準株(ATCC15488)、陰溝腸桿菌標準株(ATCC700323)、金黃色葡萄球菌標準株(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌標準株(ATCC1705)和大腸埃希菌標準株(ATCC25922)，含有Hi fucK基因質粒的大腸埃希菌凍存于本研究室。

1.2儀器與試劑 ABI公司Prism@7500型熒光定量PCR儀；高純度質粒小提試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0500S，生產批號20121)；通用型柱式基因組提取試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，貨號CW2298S，生產批號40137)；PCR熒光染料為ULtra SYBR Mixture(康為世紀生物科技有限公司，貨號CW2601M，生產批號10209)。

1.3方法

1.3.1構建標準品 復蘇凍存于-80 ℃冰箱的含有Hi fucK基因的大腸埃希菌，構建質粒，采用康為世紀高純度質粒小提試劑盒提取質粒，實驗操作參考產品說明書。對提取的質粒進行定量分析，10倍稀釋構建水平為108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的質粒作為標準品，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2設計并合成引物 針對Hi的fucK基因設計引物Hi-F/Hi-R，引物序列Hi-F：ATGGCGGGAACATCAATGA；Hi-R：ACGCATAGGAGGGAAATGGTT。引物由美國Invitrogen公司合成，經HPLC方式純化。

1.3.3繪制標準曲線 以標準品為模板進行染料法熒光定量PCR，繪制標準曲線。熒光定量PCR反應體系：2×Taqman緩沖液10 μL，引物Hi-F/Hi-R各0.3 μL， DNA 模板2.0 μL，ddH2O 8.0 μL，總體積20.0 μL。反應條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用ABI公司7500型熒光定量PCR儀的SDS軟件分析實驗結果并繪制標準曲線。

1.3.4方法學驗證 (1)敏感度：將構建的標準品稀釋為107、106、105、104、103、102、10 copy/μL，采用和繪制標準曲線時相同的反應體系和反應條件，檢測新建的實時熒光定量PCR的敏感度。(2)特異度：以本實驗室保存的肺炎支原體、人型支原體、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的DNA作為檢測模板，驗證新建的實時熒光定量PCR特異度。(3)檢驗臨床標本：采集的226份兒科患兒的咽拭子標本，均采用通用型柱式基因組提取試劑盒提取DNA，實驗操作參考產品說明書。用新建的實時熒光定量PCR檢測Hi的感染情況，反應體系和條件均參照構建標準曲線時采用的體系和條件。根據標本擴增的Ct值≤38、Tm值與標準品相符，且結合擴增曲線、溶解曲線，判定為陰陽性。

2 結 果

2.1標準曲線 10倍梯度稀釋用標準株提取的質粒，108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的質粒標準品，用Hi-F/Hi-R引物分別擴增標準品，以標準品水平為橫坐標，對應的Ct值為縱坐標，采用SDS軟件分析實驗結果并繪制標準曲線。標準曲線方程：Y=-3.335 976X+35.492 149(R2=0.999)；模板量與Ct值具有良好的相關性，能夠對模板定量。見圖1。

圖1 標準曲線

2.2敏感度 10倍梯度稀釋用標準株提取的質粒，108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的質粒標準品，用Hi-F/Hi-R引物分別擴增標準品，檢驗新建熒光定量PCR的敏感度。新建實時熒光定量PCR可檢測拷貝數(shù)為10 copy的基因模板。見圖2。

注：108、107、106、105、104、103、102、10分別代表標準品模板拷貝量

圖2標準品擴增曲線

2.3特異度 大腸埃希菌、陰溝腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、肺炎克雷伯菌和人型支原體標準株的DNA作為檢測模板，驗證新建實驗室診斷方法的特異度。結果顯示以上幾種病原體DNA均為陰性，新建實驗室診斷方法具有良好的特異度。見圖3。

注：A為Hi標準品；B為陰溝腸桿菌標準株；C為大腸埃希菌標準株；D為肺炎支原體標準品；E為金黃色葡萄球菌標準品；F為人型支原體標準品；G為肺炎克雷伯菌標準株

圖3 Hi的標準品與其他菌株標準株的溶解曲線

2.4臨床標本檢測 用新建實時熒光定量PCR檢測臨床標本提取的DNA，結果顯示，226份咽拭子標本Ct值≤38，Tm值與標準品相符；結合擴增曲線、溶解曲線，判定為陽性，陽性檢出率為40.70%。PCR陽性產物測序(由生工生物工程股份有限公司完成)并與美國國立生物技術信息中心(NCBI)已發(fā)布的Hi菌株的基因序列比對，陽性率為92.3%。見圖4。

注：A為溶解曲線；B為擴增曲線

圖4臨床標本、Hi標準品的溶解曲線與擴增曲線

3 討 論

有研究報道，綜合192個國家的流行病學調查顯示，肺炎仍是導致兒童死亡的首要病因，其中由Hi引起的死亡占16.0%，我國由Hi感染引起的死亡占21.2%，高于世界平均水平[4-5]?？赡苡捎贖i感染的臨床表現(xiàn)及胸部X線征象缺乏特異性，診斷Hi感染往往需要結合實驗室診斷方法[6]。對Hi感染的早期、快速、準確診斷對指導臨床合理規(guī)范用藥至關重要。

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)被認為是診斷Hi感染的金標準，但培養(yǎng)所需時間較長(36～72 h)，難以實現(xiàn)快速鑒定[7]，對臨床早期診斷的意義不大。該方法受培養(yǎng)條件、標本保存與運輸、實驗室培養(yǎng)條件等諸多因素影響。有報道稱，經改良培養(yǎng)基后，Hi分離率有所提高，也僅為59.9%[8-9]。血清學診斷方法主要通過檢測血清中的特異性抗原、抗體滴度的變化等判斷病原體感染，有研究報道其敏感度高于分離培養(yǎng)[10]。但血清抗體產生需4～5 d,不能進行快速檢測，且容易產生假陰性。因此，血清學診斷方法常用于回顧性診斷，不建議作為確診依據[11-12]。

分子生物學診斷技術自1990年首次用于Hi的鑒定后，因其快速、敏感、特異、簡單等優(yōu)點，受到國內外學者的廣泛關注。目前已報道的分子生物學診斷Hi感染的方法有傳統(tǒng)PCR、巢式PCR、多重PCR、高分辨率溶解曲線等[13]。NAKHJAVANI等[14]將PCR用于Hi的檢測，并與常規(guī)培養(yǎng)法和血清學方法比較,PCR使檢出率明顯提高。理論上認為實時定量PCR較傳統(tǒng)PCR更敏感，并可實時監(jiān)測，實驗過程中即可判斷結果。實時定量PCR較巢式PCR，可以減少核酸污染問題，操作更簡便。實時定量PCR相較于多重PCR，用時更短，實驗條件更易優(yōu)化，敏感度更高。有研究顯示，以實時定量PCR為參考標準，多重PCR的敏感度、特異度分別僅為30.0%、75.0%[15]。

COUGHLAN等[16]研究證實，fucK基因是目前發(fā)現(xiàn)的Hi特異度、敏感度最高，應用最廣的基因。本研究針對Hi的fucK基因設計引物，保障引物設計的合理性、可行性。相對于探針法，染料法不需要設計特異性探針，成本更低，更簡單。熒光定量PCR相對于常規(guī)分離培養(yǎng)和血清學診斷更加快速、簡易。本方法可檢測Hi基因拷貝數(shù)為10 copy的樣品，相較于商品試劑盒[17]，其具有較高的敏感度，且成本較低。采用幾種不同常見細菌DNA標本，驗證其特異度，本實驗中幾種病原不存在交叉反應，具有良好的特異度。但所選用的特異性實驗菌種較為有限，在后續(xù)研究中，還應選擇更多的菌種進行實驗，對其特異度進一步的驗證。完善和優(yōu)化實驗條件后，226份臨床標本檢出Hi陽性92份，陽性率為40.70%。其PCR陽性產物測序與NCBI已發(fā)布的HI菌株的基因序列比對，準確率為92.3%。

綜上所述，本研究中建立的實時定量PCR檢測Hi的實驗室診斷方法具有早期、快速、簡便、靈敏的優(yōu)勢，是Hi感染臨床診斷、流行病學調查、混合感染判定的可行手段，具有較高的推廣應用價值。

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