王 寧，胡志芳，李愛連，姜鳳良

(西安醫(yī)學院 免疫學教研室， 陜西 西安 710021)

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種多關節(jié)滑膜炎性反應為特點的自身免疫性疾病[1]。雞Ⅱ型膠原蛋白誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis, CIA)小鼠為人類RA研究的經(jīng)典動物模型[2]。濾泡輔助性T(T follicular helper，Tfh)細胞可促進淋巴濾泡生發(fā)中心的形成、B淋巴細胞的發(fā)育和高親和力抗體的產(chǎn)生，高表達趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor type，CXCR)5和協(xié)同刺激性因子(inducible costimulatory，ICOS)，而濾泡調(diào)節(jié)性T(T follicular regulatory，Tfr)細胞表達叉頭盒蛋白3(forkhead/winged-helix transcription factor box P3, Foxp3)、CXCR5和ICOS，通過抑制Tfh細胞活性、生發(fā)中心 B 細胞的類別轉(zhuǎn)換和抗體分泌來維持機體免疫耐受[3]。因此，Tfh和Tfr細胞數(shù)量及其比例變化與機體免疫穩(wěn)態(tài)維持和自身免疫性疾病發(fā)生均有密切關系。本研究旨在評估Tfh和Tfr細胞數(shù)量、比例與CIA病程相關性，探討其在RA發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：雞Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑(Sigma公司)；RPMI 1640(Hyclone公司)，胎牛血清(浙江四季青公司)，小鼠淋巴細胞分離液(深圳達科為公司)，青鏈霉素混合液(北京博艾爾公司)，小鼠Percp-CD4、PE-CXCR5、APC-ICOS、Alexa Fluor 488-Foxp3熒光抗體和IgG同型抗體(Biolegend公司)。

1.1.2 實驗動物：SPF級C57BL/6雄性小鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量為20.0±0.5 g(第四軍醫(yī)大學)，許可證編號XJYYLL- 2014435。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及處理：將小鼠分為對照組、CIA病程早期組、中期組和晚期組共4組，每組各15只。將雞Ⅱ型膠原(ColⅡ)溶解于0.01 mol/L冰醋酸中，混勻后4 ℃過夜，將完全弗氏佐劑(CFA)與Col Ⅱ等體積混合，研磨至油包水狀態(tài)。麻醉小鼠后尾跟部皮下注射100 μL。首次免疫后第21天相同方法和劑量進行2次加強免疫。對照組小鼠按照上述方法和時間注入等量0.9%氯化鈉溶液。ColⅡ免疫組小鼠足關節(jié)紅腫變形，提示造模成功。造模后進行疾病觀察并進行病情評估，確定再次免疫后8～12 d為病程早期，22～26 d為病程中期，30～35 d為病程晚期，分別處死小鼠，分離脾臟和外周淋巴結。

1.2.2 小鼠病情和關節(jié)AI評分：每日觀察足爪關節(jié)腫脹情況，用關節(jié)炎指數(shù)(arthritis index, AI)衡量病變情況，病變程度參考以下評分[7]。0級：關節(jié)正常，無紅腫；1級：關節(jié)紅但無腫大；2級：關節(jié)輕度紅腫；3級：關節(jié)中度紅腫；4級：關節(jié)重度紅腫伴隨功能障礙。每只小鼠病情評分為其四肢關節(jié)分數(shù)的總和。

1.2.3 流式細胞術檢測病情高峰期小鼠脾臟和淋巴結Tfh細胞： 制備脾臟和淋巴結單細胞懸液5×106個細胞，利用錐蟲藍拒染法確定活細胞>95%。Tfr和Tfh細胞數(shù)量和比例測定：收集各組細胞，調(diào)整細胞量并去除培養(yǎng)基，分別加入：Percp-CD4抗體1.25 μL、PE-CXCR5抗體2.5 μL、APC-ICOS抗體2.5 μL和Alexa Fluor 488-Foxp3抗體2.5 μL，設置同型管和補償管；混勻，4 ℃放置30 min后徹底洗滌，加200 μL甲醛固定液保存待上機，所測結果使用FlowJo 10軟件分析。

2 結果

2.1 CIA小鼠病情評估: 加強免疫后CIA小鼠出現(xiàn)活動力

降低、進食減少和體質(zhì)量下降，尾根部皮膚漸紅腫潰瘍，背部皮膚出現(xiàn)片狀潰瘍；疾病早期AI指數(shù)為(1.93±1.32)；疾病中期為(5.73±2.12)；疾病晚期為(3.14±1.58)。

2.2 CIA小鼠病程中期和晚期脾臟、淋巴結Tfr細胞比例變化:CIA小鼠病程中期脾臟Tfr細胞在CD4+T中所占比例明顯低于對照組小鼠(P<0.001)；病程晚期所占比例較中期明顯升高(P<0.01)(圖1,圖2A)。病程中期淋巴結Tfr細胞所占比例明顯低于對照組小鼠(P<0.01)；病程晚期所占比例較中期明顯升高(P<0.05)(圖1,圖2B)。

2.3 CIA小鼠病程中期和晚期脾臟、淋巴結Tfh細胞比例變化:CIA小鼠病程中期脾臟Tfh細胞所占比例明顯高于對照組小鼠(P<0.01)，也明顯高于病程中期小鼠；病程晚期較中期明顯降低(P<0.05)(圖1,圖3A)。病程早期淋巴結中Tfh細胞較對照組明顯升高(P<0.01)；病程晚期較中期明顯降低(P<0.05)(圖1,圖3B)。

2.4 CIA小鼠病程中期和晚期脾臟、淋巴結Tfr/Tfh比值的比較:CIA小鼠病程早期脾臟Tfr/Tfh開始低于對照組(P<0.05)；中期明顯降低(P<0.001)；CIA小鼠病程晚期脾臟Tfr/Tfh比值較中期明顯升高(P<0.01)(圖4A)。病程早期淋巴結Tfr/Tfh明顯降低(P<0.05)，中期降低最為明顯，病程晚期淋巴結Tfr/Tfh比值較中期明顯升高(P<0.05)(圖4B)。

3 討論

本實驗應用人類RA經(jīng)典動物模型CIA模型，檢測小鼠RA病程中脾臟和淋巴結Tfr和Tfh細胞數(shù)量比例和變化規(guī)律。在病程3個時期中，脾臟和淋巴結中Tfh細胞比例與AI評分趨勢始終一致，說明Tfh細胞可能通過激活體液免疫應答參與和促進RA病程進展。此外， Tfr/Tfh穩(wěn)態(tài)對于調(diào)節(jié)生發(fā)中心B細胞以維持免疫平衡至關重要[4]。通過檢測RA病程中脾臟和淋巴結Tfr細胞比例，明確其與AI評分和Tfh細胞比例趨勢剛好相反，提示RA病程早期和中期Tfr細胞數(shù)量比例降低與機體過強異常免疫應答存在密切關聯(lián)，晚期Tfr細胞參與對異常體液免疫應答的調(diào)控過程以維持免疫穩(wěn)態(tài)。

圖1 各組脾臟和淋巴結CD4+T 細胞中Tfr和Tfh細胞比例Fig 1 The proportion of Tfr and Tfh in CD4+ T cells in spleen and lymph node of each group

A.Tfr percentage in CD4+T cell of spleen between each group; B.Tfr percentage in CD4+T cell of lymph node between each group;*P<0.05，**P<0.001 compared with control group；△P<0.01 compared with early stage group;#P<0.05 compared with middle stage group

A.Tfh percentage in CD4+T cell of spleen between each group; B.Tfh percentage in CD4+T cell of lymph node between each group;*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with early stage group;#P<0.05 compared with middle stage group

A.Thr/Tfh ratio in spleen between each group; B.Tfr/Tfh ratio in lymph node between each group;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with control group；△P<0.01 compared with early stage group;#P<0.01 compared with middle stage group

本實驗用CIA小鼠系統(tǒng)性對病程中Tfh和Tfr細胞變化規(guī)律進行分析，明確Tfh和Tfr細胞通過動態(tài)調(diào)控參與RA病理進程階段，此研究不僅對于評估RA患者體內(nèi)體液應答水平具有一定參考價值，而且為Tfh和Tfr成為可行性細胞治療靶點提供研究基礎。

[1] Barhamain AS, Magliah RF, Shaheen MH,etal. The journey of rheumatoid arthritis patients: a review of reported lag times from the onset of symptoms[J].Open Access Rheumatol, 2017,28:139- 150.

[2] Kurkó J,Besenyei T,Laki J,etal.Genetics of rheumatoid arthritis-a comprehensive review[J].Clin Rev Allergy Immunol, 2013,45:170- 179.

[3] Ye L, Jiang B, Deng J,etal.IL- 37 alleviates rheumatoid arthritis by suppressing IL- 17 and IL- 17-triggering cytokine production and limiting Th17 cell proliferation[J].J Immunol, 2015,194:5110- 5119.

[4] Park HJ, Kim DH, Lim SH,etal. Insights into the role of follicular helper T cells in autoimmunity[J]. Immune Netw, 2014, 14:21- 29.