劉雅婷，李 鑫，王 娜，宋飛雪

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科， 甘肅 蘭州 730000)

在腫瘤發(fā)展的早期，氧氣是限制腫瘤生長的因素，其主要原因在于早期腫瘤細(xì)胞快速增殖，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部氧氣的供應(yīng)小于消耗，造成低氧，此時(shí)細(xì)胞還未激活腫瘤細(xì)胞抗低氧基因和相關(guān)信號通路，例如HIF- α、糖酵解和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[1]。當(dāng)腫瘤發(fā)展至后期時(shí)，低氧微環(huán)境可以促進(jìn)腫瘤的生長，目前研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)作用可以通過多種途徑實(shí)現(xiàn)，低氧可以誘導(dǎo)HIF- α表達(dá)升高，激活腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，通過“吃自己”抵抗低氧引起的營養(yǎng)供應(yīng)不足[2]，激活血管生成，轉(zhuǎn)變腫瘤細(xì)胞的供能方式，由氧化磷酸化為主向糖酵解為主轉(zhuǎn)變[3]，提高腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[4]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)低氧可通過啟動(dòng)凋亡抑制SW480細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，通過啟動(dòng)自噬保護(hù)CD133+免于凋亡[5]，其具體的分子機(jī)制并未被闡釋，本實(shí)驗(yàn)將對低氧引起的這種在不同細(xì)胞類型上的自噬差異進(jìn)行初步的探索，為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480(中國科學(xué)院上海生物研究所)；CD133+細(xì)胞(磁珠分選SW480細(xì)胞中CD133表達(dá)陽性亞群)；人結(jié)腸癌組織：收集甘肅省人民醫(yī)院病理科2008年6月至2009年9月手術(shù)切除的94例結(jié)直腸癌標(biāo)本。其中男性56例，女性38例，年齡27～ 80歲，中位年齡56歲。按照2000年版世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對以上標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)分型和病理分級，其中，1)按Duke’s分期：A期2例；B期53例；C期34例；D期5例。2)按組織學(xué)類型：Ⅰ級，高分化管狀和乳頭狀腺癌1例；Ⅱ級，中分化腺癌67例；Ⅲ級，低分化腺癌和印戒細(xì)胞癌26例。3)按部位：結(jié)腸癌16例，直腸癌78例。4)按有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移42例，無轉(zhuǎn)移52例。

1.1.2 主要試劑:細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12(PeproTech公司)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；CD133磁性微珠(Miltenyi公司)；B27(Sigma公司)；bFGF(PeproTech公司)；EGF(Gibco公司)；抗HIF- 2α抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；SP9001免疫組化試劑盒(中杉金橋公司)，Western blot所有抗體(Solarbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠分選SW480細(xì)胞：取10瓶常規(guī)培養(yǎng)的處于對數(shù)增殖期SW480 細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)為107個(gè))，按免疫磁珠分選說明書進(jìn)行分選，將分選后得到的CD133+細(xì)胞與未分選的SW480行常規(guī)培養(yǎng)和低氧(1% O2)培養(yǎng)，其中CD133+細(xì)胞培養(yǎng)于含 2% B27、 20 μg/L bFGF、20μg/L EGF的 DMEM/F12培養(yǎng)基中，每3 d加液1次，分別于分選后 0、7和14 d倒置顯微鏡觀察細(xì)胞增殖情況。

1.2.2 免疫熒光檢測HIF- 2α表達(dá)：取對數(shù)增殖期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種到預(yù)先處理好的6孔板中的蓋玻片上，孵箱培養(yǎng)1 d，待細(xì)胞貼壁后分別在正常氧含量及低氧含量的微環(huán)境中培養(yǎng)48 h，取出蓋玻片，浸入PBS洗2次，每次5 min，95%乙醇固定10 min；PBS洗3次，每次5 min，0.2% Triton- 100透化30 min；PBS洗滌3次，每次5 min，5% BSA室溫封閉30 min；加入一抗放在濕盒里4℃過夜，取出37 ℃孵育45 min；PBS洗滌3次，每次5 min，加入二抗30 min避光；PBS洗滌3次，每次5 min，加入DAPI避光30 min；PBS洗滌3次，每次5 min，95%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞將在胞質(zhì)及胞膜處出現(xiàn)綠色熒光。

1.2.3 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)：取預(yù)處理的SW480及CD133+細(xì)胞，消化后，收集于2 mL離心管中，PBS低溫離心洗滌后，置于冰上，每組加入200 μL細(xì)胞裂解液，再加入10 μL/mL 的PMSF，吹打均勻，超聲波破碎，每組細(xì)胞重復(fù)10次，然后渦旋振蕩15 s，冰上放置10 min，重復(fù)3次。恒溫離心機(jī)溫度控制于4 ℃、15 000 r/min離心30 min，收集上清，得到蛋白裂解液，最后進(jìn)行分裝，每管50 μL，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用Bradford法測定各組蛋白含量后，取出已經(jīng)分裝好的蛋白，加入5×上樣緩沖液，沸水中煮10 min，冷卻后加入預(yù)先制好的SDS-PAGE凝膠中，進(jìn)行電泳，待其電泳完成后，將分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，進(jìn)行免疫印跡雜交，其中GAPDH抗體1∶1 000稀釋，LC3抗體1∶1 500稀釋。顯影之后的膠片利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行掃描，再利用IPWIin51軟件分析，對每個(gè)條帶進(jìn)行定量，最終將圖像的觀察轉(zhuǎn)為定量的結(jié)果。

1.2.4 免疫組化染色檢測HIF- 2α和Beclin的表達(dá)：組織切片60 ℃恒溫箱中烤片過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，溫水漂洗，蒸餾水浸泡，檸檬酸鈉修復(fù)，自然冷卻，蒸餾水沖洗，然后按免疫組化試劑盒說明操作。結(jié)果判定：HIF- 2α和Beclin組織切片顯示以胞質(zhì)染色為淡黃色至棕褐色顆粒者為陽性。于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)有代表性的不同視野，每個(gè)視野的得分由陽性染色細(xì)胞所占面積和細(xì)胞染色強(qiáng)度兩者計(jì)分之和來判斷。染色面積計(jì)分為：陽性染色細(xì)胞<5%計(jì)0分；5%～25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；>50%計(jì)3分。細(xì)胞染色強(qiáng)度：不染色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。若兩種計(jì)分之和≤2，則為陰性表達(dá)，>2則為陽性表達(dá)。(-)為陰性，(+)為弱陽性表達(dá)，(++)～(+++)為強(qiáng)陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧微環(huán)境對SW480細(xì)胞系HIF- 2α表達(dá)的影響

較對照組，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞中HIF- 2α的表達(dá)上升，并且隨著低氧處理時(shí)間的增長，HIF- 2α的表達(dá)量不斷增加(圖1)。

2.2 低氧對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3的影響

低氧誘導(dǎo)SW480和CD133+細(xì)胞中LC3Ⅰ表達(dá)增加。但隨著低氧時(shí)間增長，SW480細(xì)胞中LC3Ⅱ表達(dá)逐漸減少，CD133+細(xì)胞中LC3Ⅱ表達(dá)逐漸增加 (圖2,3)。

2.3 HIF- 2α及Beclin1在結(jié)直腸組織中的表達(dá)

2.3.1 HIF- 2α在結(jié)直腸組織中的表達(dá)：在結(jié)直腸癌組織中例中，高中分化組HIF- 2α在腫瘤細(xì)胞中陽性表達(dá)率為60.3%，低分化組HIF- 2α在腫瘤細(xì)胞中陽性表達(dá)率為84.6%，低分化組HIF- 2α的表達(dá)率大于高分化組(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中HIF- 2α的表達(dá)率為52.4%，顯著低于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中78.8%(P<0.05)。HIF- 2α的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、浸潤深度、Duke、S分期以及生長部位無明顯相關(guān)性(圖4)。

A .immuhistochemistry;B.statistical analynasis results of A；*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with hypoxia 24 hours goup

圖2 低氧對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響Fig 2 Effects of hypoxia on colon cancer cell autophagy-related protein

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with hypoxia 24h group圖3 低氧對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的影響Fig 3 Effects of hypoxia on colon cancer cell autophagy-related protein LC3Ⅱ

2.3.2 Beclin1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)：在結(jié)直腸癌組織中(94例)中，高中分化組Beclin1的表達(dá)率為63.2%，顯著低于低分化組的84.6%(P<0.05)；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組中Beclin1的表達(dá)率為78.6%高于無轉(zhuǎn)移組中的57.7% (P<0.05)。Duke、s分期的A-B期中Beclin1的表達(dá)率為56.4%低于C-D期的82.1%(P<0.01)。Beclin1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、浸潤深度及生長部位無明顯相關(guān)性(圖4)。

3 討論

低氧作為腫瘤微環(huán)境的一個(gè)主要特點(diǎn)，在腫瘤發(fā)展的不同時(shí)期起著不同的作用[4]。HIF- α在低氧環(huán)境中最先被誘導(dǎo)表達(dá)，激活下游多種細(xì)胞抗低氧相關(guān)基因的表達(dá)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480中，CD133+細(xì)胞是一類具有干細(xì)胞特性的癌細(xì)胞。低氧可以維持CD133+細(xì)胞的表型、抑制其向成熟的腫瘤細(xì)胞分化[6]。自噬在生物發(fā)育、維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)、衰老等方面起重要作用[7]，但在某些腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)自噬可保護(hù)細(xì)胞免受凋亡[8]。研究顯示在SW480細(xì)胞系中，低氧可誘導(dǎo)大部分SW480細(xì)胞死亡，卻能促進(jìn)CD133+細(xì)胞發(fā)生自噬規(guī)避凋亡[5]。

本實(shí)驗(yàn)中，免疫熒光結(jié)果顯示，與常氧環(huán)境中相比，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)SW480 細(xì)胞中HIF- 2α表達(dá)上升并在細(xì)胞膜周圍不斷聚集。研究顯示HIF- 2α可激活BNIP3和NIX的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制Beclin3和Bcl- 2的功能，抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)NIX表達(dá)WXXL基序，該基序可被LC3識別并結(jié)合[9]，導(dǎo)致產(chǎn)生自噬。Western blot結(jié)果顯示低氧誘導(dǎo)SW480和CD133+細(xì)胞中LC3Ⅰ表達(dá)增加。但隨著低氧時(shí)間增長，SW480細(xì)胞中LC3Ⅱ表達(dá)逐漸減少，CD133+細(xì)胞中LC3Ⅱ表達(dá)逐漸增加，表明導(dǎo)致在低氧環(huán)境中CD133+細(xì)胞存活能力強(qiáng)的原因在于自噬的增強(qiáng)。

圖4 Beclin1和HIF- 2α在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)Fig 4 Positive expression of Becline1 and HIF- 2α in colorectal carcinoma

本實(shí)驗(yàn)選取HIF- 2α及Beclin1，觀察二者在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)。在結(jié)腸癌組織學(xué)實(shí)驗(yàn)中，HIF- 2α的表達(dá)率在低分化組中高于高分化組，在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中高于淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組。Beclin1表達(dá)率在低分化組高于高分化組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。Duke、S分期中，Beclin1陽性表達(dá)率C-D期高于A-B期(P<0.05)。而HIF- 2α和Beclin1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、浸潤深度及生長部位不相關(guān)。HIF- 2α在低氧時(shí)會(huì)聚集，雖然之前有報(bào)道提示HIF- 2α的表達(dá)在腫瘤組織中會(huì)受限[10]，但在本實(shí)驗(yàn)中高表達(dá)。隨著結(jié)腸癌組織分化程度的降低惡性度越高，組織發(fā)生缺氧程度越高，自噬水平越高；低氧微環(huán)境及自噬在結(jié)腸癌發(fā)生中可能具有促進(jìn)作用。

綜上可知低氧可引起SW480細(xì)胞HIF的升高，促進(jìn)LC3的表達(dá)，從而啟動(dòng)大部分SW480細(xì)胞自噬性凋亡，但對于SW480細(xì)胞中一小部分CD133+細(xì)胞，由低氧引起的自噬并不能使其發(fā)生凋亡，而是通過自噬將細(xì)胞器降解，為癌細(xì)胞存活提供營養(yǎng)物質(zhì)。

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