劉衍冬，金 偉，鄧琴琴，裴兆輝

(南昌市第三醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

吸煙嚴重危害人類健康，香煙煙霧會導致遺傳毒性和致突變效應[1- 2]，但香煙煙霧成分對心肌結構和功能影響的機制研究很少。最近報道，一種主要存在于香煙煙霧中的污染物α，β-不飽和醛能損傷心肌細胞[3]，其機制仍不太清楚。本文研究巴豆醛，一種存在于香煙煙霧中的主要α，β-不飽和醛和脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，對小鼠心肌細胞收縮功能的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：6～8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～25 g[湖南省斯萊克景達有限公司，許可證號：SYXK(贛)2010- 0002]。

1.1.2 主要試劑：巴豆醛(西亞試劑公司)；Na+-Ca2+交換體抗體和GAPDH抗體(Santa Cruz公司)；BCA蛋白測定試劑盒(APPLYGEN公司)；超敏ECL化學發(fā)光試劑(Thermo Scientific公司)；fura- 2/AM(Invitrogen公司)；其他分析純購買于天津大茂化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌細胞的分離和藥物處理：常規(guī)麻醉小鼠后，取出心臟懸掛于Langendorff裝置上用KHB緩沖液灌注(mmol/L)：118 NaCl，4.7 KCl，1.2 MgSO4，1.2 KH2PO4，25 NaHCO3，10 HEPES，11.1 Glucose。具體步驟參照文獻[4]。分離出的小鼠心肌細胞與不同濃度(1、10、25和50 μmol/L)巴豆醛孵育6 h，對照組不經(jīng)巴豆醛處理，所有實驗在環(huán)境溫度25 ℃下進行。

1.2.2 心肌細胞收縮/舒張功能的測定：用SoftEdge MyoCam系統(tǒng)檢測心肌細胞的機械功能，具體步驟參照文獻[4]，分別檢測心肌細胞收縮峰值(peak shortening，PS)、收縮峰值時間(time-to-PS，TPS)、舒張90%時間(time-to-90% relengthning，TR90)以及最大收縮/舒張速率(maximal velocity of shortening/relengthening，±dL/dt)。

1.2.3 心肌細胞內(nèi)Ca2+功能的測定：將fura- 2/AM(0.5 μmol/L)與小鼠心肌細胞在室溫下避光孵育10 min，用雙激發(fā)熒光光電倍增系統(tǒng)檢測熒光信號，具體步驟參照文獻[5]。細胞內(nèi)的游離Ca2+熒光指示劑被激發(fā)，其在480 nm和520 nm處波長熒光下記錄fura- 2熒光強度(fura- 2 fluorescence intensity，F(xiàn)FI)、ΔFFI，熒光延遲時間用細胞內(nèi)Ca2+的清除率來衡量。

1.2.4 SERCA45Ca2+攝取的測定：小鼠心肌細胞經(jīng)不同濃度(1、10、25和50 μmol/L)巴豆醛處理6 h后，制作心肌細胞勻漿并溶解在勻漿緩沖液中：30 mmol/L Tris-HCl，8%蔗糖，1 mmol/L PMSF和2 mmol/L二硫蘇糖醇。心肌細胞與SERCA抑制劑毒胡蘿卜素(10 μmol/L)一起孵育15 min，加與未加毒胡蘿卜素濾膜放射性之差為毒胡蘿卜素依賴的SERCA45Ca2+攝取量。具體步驟參照文獻[6]。

1.2.5 Western blot檢測Na+-Ca2+交換體蛋白：心肌細胞經(jīng)細胞裂解液裂解后提取總蛋白，按BCA法檢測蛋白濃度。取等量蛋白樣品，SDS-PAGE膠電泳后將分離的蛋白質(zhì)轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，加入按相應比例稀釋Na+-Ca2+交換體抗體及內(nèi)參GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗膜除去過量的一抗，然后加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜。最后ECL發(fā)光顯影，采用Image LabTM軟件分析曝光條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同濃度巴豆醛對小鼠心肌細胞收縮功能的影響

巴豆醛對小鼠心肌細胞的整體形態(tài)無明顯影響(圖1)。與對照組相比，25和50 μmol/L的巴豆醛能明顯降低小鼠心肌細胞PS和±dL/dt(P<0.05)，并能延長TR90(P<0.05)(圖2)。

2.2 不同濃度巴豆醛對小鼠心肌細胞內(nèi)Ca2+功能的影響

與對照組相比，25和50 μmol/L的巴豆醛能明顯減少小鼠心肌細胞內(nèi)ΔFFI和延緩心肌細胞內(nèi)Ca2+衰減(P<0.05)，但不影響靜息和峰值心肌細胞內(nèi)FFI(圖3)。

2.3 不同濃度巴豆醛對小鼠心肌細胞內(nèi)SERCA 45Ca2+攝取及Na+-Ca2+交換體的影響

與對照組相比，較高濃度巴豆醛(25和50 μmol/L)能抑制小鼠心肌細胞SERCA活性(P<0.05)，而低濃度巴豆醛(1和10 μmol/L)對SERCA活性無抑制作用(圖4A)；巴豆醛對小鼠心肌細胞Na+-Ca2+交換體的表達無明顯影響(圖4B)。

3 討論

香煙煙霧中的α，β-不飽和醛被認為是慢性吸煙誘發(fā)的組織器官損傷的主要因素之一[7- 8]。巴豆醛是一種重要的α，β-不飽和醛，它能與呼吸道黏液系統(tǒng)或細胞大分子物質(zhì)發(fā)生反應[9]。

本研究采用單個小鼠心肌細胞進行實驗，其優(yōu)點是能準確地控制心肌細胞所處的外環(huán)境，避免來自周圍成纖維細胞、內(nèi)皮細胞代謝和擴散屏障的干擾[5]。小鼠心肌細胞與不同濃度巴豆醛孵育6 h后，并不影響小鼠心肌細胞的整體形態(tài)，但它能明顯降低心肌細胞PS、±dL/dt和細胞內(nèi)Ca2+釋放，并延長心肌細胞TR90和延緩細胞內(nèi)Ca2+衰減，導致小鼠心肌細胞收縮/舒張功能損害和細胞內(nèi)Ca2+功能異常。

圖1 不同濃度巴豆醛對小鼠心肌細胞形態(tài)的影響Fig 1 Effect of crotonaldehyde with different concentrations on cardiomyocytes morphology in mouse(×200)

A.resting cell length; B.peak shortening (% of resting cell length); C.maximal velocity of shortening (+dL/dt); D.maximal velocity of relengthening (-dL/dt); E.time-to-peak shortening (TPS); F.time-to-90% relengthening (TR90);*P<0.05 compared with control group

圖2不同濃度巴豆醛對小鼠心肌細胞收縮/舒張功能的影響

A.resting fura- 2 fluorescence intensity (FFI); B.peak FFI; C.increase of FFI (ΔFFI) in response to electrical stimuli; D.intracellular Ca2+decay;*P<0.05 compared with control group

圖3不同濃度巴豆醛對小鼠心肌細胞Ca2+功能的影響

A.SERCA activity measured by45Ca2+uptake; B.Na+-Ca2+exchanger expression; Inset: representative gel bots depicting expression of Na+-Ca2+exchanger and GAPDH;*P<0.05 compared with control group

圖4不同濃度巴豆醛對小鼠心肌細胞Na+-Ca2+交換體表達及SERCA45Ca2+攝取的影響

長期給小鼠喂食丙烯醛(一種α，β-不飽和醛)誘導小鼠擴張型心肌病后，小鼠左心室明顯擴張，并且其左室收縮功能及舒張功能明顯受損[3]，這與本結果相一致。進一步實驗證實，巴豆醛能抑制心肌細胞SERCA功能而不影響Na+-Ca2+交換體的表達，從而影響心肌細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)。心肌細胞經(jīng)巴豆醛處理后其收縮能力減弱是由于巴豆醛影響了心肌細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，香煙煙霧可通過引起心肌細胞內(nèi)Ca2+紊亂導致小鼠心臟收縮功能障礙[4]，提示心肌細胞內(nèi)Ca2+紊亂是巴豆醛誘導小鼠心肌收縮功能障礙的重要機制。SERCA和Na+-Ca2+交換體在心肌舒張期時將細胞質(zhì)中的Ca2+轉入到細胞外發(fā)揮重要作用[10- 11]。本實驗觀察到巴豆醛能明顯降低SERCA活性，導致肌漿網(wǎng)(SR)對Ca2+攝取降低，從而細胞內(nèi)Ca2+增加，引起心肌舒張功能障礙(延長心肌細胞TR90和延緩細胞內(nèi)Ca2+衰退)。已證實氧自由基通過抑制L型Ca2+電流、Na+-Ca2+交換和SR Ca2+攝取而破壞心肌細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)[12- 14]，進而影響心肌細胞收縮功能。因此，巴豆醛可能還通過氧化應激來誘導心肌細胞心臟收縮功能障礙。下一步筆者將針對巴豆醛誘導的氧化應激揭示巴豆醛誘導心肌細胞損傷的另一機制。

綜上所述，巴豆醛可抑制小鼠心肌細胞內(nèi)SERCA活性，導致心肌細胞內(nèi)Ca2+功能異常，從而抑制心肌細胞的收縮功能。

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