洪慧慧 王立波 祁媛媛

肺炎是兒童常見(jiàn)疾病，發(fā)病率高［1］，也是兒童死亡的主要原因，占兒童死亡原因的15．5%［2］，小嬰兒發(fā)病率及病死率更高。以往認(rèn)為肺炎的發(fā)病機(jī)制是單種病原體入侵并在肺部生長(zhǎng)，而新近研究認(rèn)為上、下呼吸道是一個(gè)復(fù)雜且相連的微生物生態(tài)系統(tǒng)，在其穩(wěn)態(tài)遭到破壞時(shí)導(dǎo)致肺炎發(fā)生［3］。生命早期呼吸道菌群紊亂可能與呼吸道感染易感性、嚴(yán)重程度和兒童哮喘的發(fā)生相關(guān)［4，5］。Vissing等報(bào)告，新生兒期咽部肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的定植增加了早期肺炎發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［6］。Sakwinska等比較了肺炎兒童與健康兒童的鼻咽部菌群變化，發(fā)現(xiàn)非病毒性肺炎患兒鼻咽部肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的豐度增高［7］。這些研究?jī)H關(guān)注了咽部的菌群變化對(duì)發(fā)生肺炎的風(fēng)險(xiǎn)的影響，由于兒童下呼吸道標(biāo)本獲取困難，使得下呼吸道菌群情況尤其是感染時(shí)的狀況知之甚少;而且，研究結(jié)果提示不同疾病時(shí)上、下呼吸道菌群存在不同的變化［8］。研究顯示，＞6月齡的肺炎兒童誘導(dǎo)痰與咽拭子的一些特定菌群與肺炎的病程相關(guān)［9］。＜6月齡嬰兒的菌群有其特殊性，且生命早期的菌群狀況對(duì)免疫系統(tǒng)成熟和呼吸系統(tǒng)發(fā)育影響巨大，本文觀察＜6月齡肺炎嬰兒的上、下呼吸道菌群狀況。

1 方法

1．1 研究設(shè)計(jì) 橫斷面調(diào)查。選擇＜6月齡的肺炎患兒，同時(shí)采集口咽拭子和支氣管肺泡灌洗液(BALF)標(biāo)本，利用16S rDNA可變區(qū)測(cè)序技術(shù)分析呼吸道微生物群落結(jié)構(gòu)，比較上、下呼吸道菌群變化。

1．2 納入標(biāo)準(zhǔn) 2017年1月1日至8月31日在復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)呼吸科住院，有咳嗽、咳痰等呼吸道癥狀，胸部X線檢查發(fā)現(xiàn)肺部有滲出影，病程＞2周，抗生素治療＞5 d，被診斷為肺炎的＜6月齡患兒。

1．3 排除(剔除)標(biāo)準(zhǔn) 診斷為肺炎同時(shí)伴以下情況:支氣管肺發(fā)育不全，閉塞性細(xì)支氣管炎，嚴(yán)重先天性心臟病，嚴(yán)重氣道狹窄或軟化，其他氣道結(jié)構(gòu)異常，真菌、支原體等特定病原體感染，有機(jī)械通氣史。

1．4 知情同意和倫理 采集上、下呼吸道標(biāo)本和行相關(guān)檢測(cè)均得到患兒家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人的知情同意，本研究獲我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(復(fù)兒倫審［2013］039號(hào))。

1．5 樣本采集 上呼吸道選取口咽拭子樣本，于入院后第2 d清晨，采用3M快速涂抹棒，樣本采集后4℃保存。下呼吸道標(biāo)本選取BALF，根據(jù)臨床需要行纖維支氣管鏡檢查，并使用生理鹽水進(jìn)行支氣管肺泡沖洗，沖洗液回收，4℃保存。咽拭子及BALF均在4 h內(nèi)完成DNA抽提。

1．6 DNA抽提 咽拭子采集管渦旋震蕩10 s后轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液到無(wú)菌離心管中，咽拭子培養(yǎng)液和BALF以14 000 r·min－1離心 10 min，棄上清液，沉淀物以 200 μL 無(wú)菌 PBS 重懸。采用德國(guó)QIAGEN公司Blood＆Tissue Kit試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書對(duì)懸浮物進(jìn)行DNA抽提。

1．7 測(cè)序及結(jié)果分析 DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量;用 338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對(duì)細(xì)菌的16S rDNA V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，USA)進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)進(jìn)行檢測(cè)定量。檢測(cè)合格的樣本根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina，USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程構(gòu)建PE 2*300的文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，使用的UPARSE軟

件(version 7．1)根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類;使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva128/16s_bacteria數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置比對(duì)閾值為0．8。微生物群落豐富度評(píng)估采用sobs指數(shù)、chao指數(shù)和ace指數(shù)，sobs指數(shù)反映實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)目，chao指數(shù)和ace指數(shù)為估計(jì)的OTU數(shù)目，3個(gè)豐富度指數(shù)均用于評(píng)估樣本的物種總數(shù);群落多樣性評(píng)估采用shannon指數(shù)和simpson指數(shù)，多樣性指數(shù)綜合評(píng)估樣本的群落豐富度和均勻度，shannon值越大說(shuō)明群落多樣性越高，simpson值越大說(shuō)明多樣性越低。采用I-Sanger生物信息學(xué)分析云平臺(tái)進(jìn)行物種組成分析。

1．8 臨床資料收集 采集患兒入院時(shí)年齡、性別、體重、出生方式等基本信息，采集治療信息等。

1．9 統(tǒng)計(jì)方法 Alpha多樣性指數(shù)組間差異性檢驗(yàn)及物種差異分析的組間差異性檢驗(yàn)采用配對(duì)符號(hào)秩檢驗(yàn)，使用SPSS 23．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;評(píng)估不同樣本的相似性和差異關(guān)系的Beta多樣性分析采用主成分分析(PCA分析)，使用R語(yǔ)言PCA統(tǒng)計(jì)分析;所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙尾檢驗(yàn)，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 一般情況 符合本文納入標(biāo)準(zhǔn)的29例患兒，排除(剔除)聲門下血管瘤、舌根囊腫、支原體感染、真菌感染和機(jī)械通氣史各1例，24例肺炎患兒進(jìn)入本文分析，男18例(75．0%)，年齡 49～ 177［130．5(88．8，164．5)］d，平均體重(6．5±1．7)kg;剖宮產(chǎn) 7 例(29．2%)，早產(chǎn) 3 例(12．5%);母乳喂養(yǎng)8例(33．3%)、奶粉喂養(yǎng)5例(20．8%)、混合喂養(yǎng)11例(45．8%);標(biāo)本采集前均曾經(jīng)靜脈抗生素治療，抗生素使用時(shí)間 6～43(15．6±7．5)d;伴有喘息 18 例;接受靜脈激素治療14例;7例(29．2%)采用呼吸支持，其中1例接受高流量鼻導(dǎo)管吸氧，6例接受鼻導(dǎo)管、面罩或頭罩吸氧;住院時(shí)間中位數(shù)為8(6，11)d。

2．2 呼吸道菌群概況 24例咽拭子和BALF樣本共得到1 766 363個(gè)有效序列數(shù)，791 005 442個(gè)有效堿基數(shù)，序列平均長(zhǎng)度為447．82，最小樣本序列數(shù)為30 179。對(duì)OTU原始序列表按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平，后續(xù)的所有分析均以抽平后的序列表為基礎(chǔ)進(jìn)行聚類分析。如圖1所示，在現(xiàn)有序列數(shù)下sobs指數(shù)及shannon指數(shù)的稀釋曲線均趨于平坦，說(shuō)明每個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中的微生物信息。

圖1 OTU水平稀釋曲線

2．3 呼吸道菌群組成分析

2．3．1 門水平 上呼吸道菌群的分類數(shù)為16，下呼吸道菌群的分類數(shù)為27，其中共有菌為13種，上、下呼吸道微生物分布見(jiàn)表1，上呼吸道菌群豐度前5位的依次是厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門，下呼吸道菌群豐度前5位的依次是變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和衣原體門(未分類細(xì)菌除外)。上、下呼吸道中序列數(shù)總和前7位的物種均為上、下呼吸道共有菌，占上、下呼吸道總細(xì)菌數(shù)的99．16%，全部共有菌占上、下呼吸道總細(xì)菌數(shù)的99．23%。未分類細(xì)菌在上、下呼吸道所占比例分別為0．16%和1．27%(表中未列出)。

2．3．2 屬水平 上呼吸道菌群的分類數(shù)為134，下呼吸道菌群的分類數(shù)為247，上、下呼吸道共有的菌屬為120種，表2顯示，上呼吸道菌群豐度前5位的依次是鏈球菌屬、假單胞菌屬、普氏菌屬-7、韋榮球菌屬和埃希氏-志賀菌屬，下呼吸道菌群豐度前5位的依次是假單胞菌屬、鏈球菌屬、普氏菌屬-7、克雷伯菌屬和羅氏菌屬。上、下呼吸道中序列數(shù)總和前42位的物種均為上、下呼吸道共有菌，占上、下呼吸道總細(xì)菌的98．63%，全部共有菌占上、下呼吸道總細(xì)菌數(shù)的98．99%。與上呼吸道相比，下呼吸道的獨(dú)有細(xì)菌更多。

表1 門水平的上、下呼吸道微生物群落分布(%)

表2 屬水平的上、下呼吸道微生物群落分布(%)

2．4 呼吸道菌群多樣性比較 上、下呼吸道菌群Beta多樣性的比較顯示(圖2)，上呼吸道菌群除了2個(gè)離散樣本外分布較集中，下呼吸道菌群樣本的分布較離散。

上、下呼吸道微生物群落Alpha多樣性的比較顯示(圖3)，下呼吸道菌群豐富度顯著高于上呼吸道，上呼吸道菌群多樣性顯著高于下呼吸道(p＜0．05)。

圖2 OTU水平的上、下呼吸道菌群主成分分析

圖3 上、下呼吸道菌群的豐富度和多樣性分析

3 討論

近年來(lái)，呼吸道微生物對(duì)免疫及疾病的作用越來(lái)越受到重視。研究提示，生命早期呼吸道菌群的變化參與了后期哮喘和過(guò)敏等疾病的發(fā)生，而慢性肺疾病如慢性呼吸道阻塞性疾病(COPD)中，呼吸道菌群紊亂伴隨著疾病的急性惡化［10，11］。近來(lái)的研究也開(kāi)始關(guān)注急性呼吸道感染時(shí)的菌群變化，但多數(shù)只對(duì)上呼吸道樣本進(jìn)行分析，急性肺炎時(shí)下呼吸道菌群的變化仍不清楚，更缺乏生命早期的菌群狀況資料。

本研究報(bào)告了經(jīng)過(guò)治療的＜6個(gè)月肺炎患兒上、下呼吸道的菌群狀況。有研究表明［12］，健康嬰兒上呼吸道菌群屬水平豐度前5位依次為鏈球菌屬、奈瑟菌屬、韋榮球菌屬、芽孢桿菌屬和普氏菌屬(未分類除外)。細(xì)支氣管炎嬰兒的上呼吸道菌群中假單胞菌屬等的相對(duì)豐度高于健康嬰兒(1．44%vs 0．19%)［12］。本研究中，上呼吸道菌群奈瑟菌屬和芽孢桿菌屬的豐度降低，假單胞菌比例較高。目前尚無(wú)健康嬰兒BALF的菌群狀況的研究資料，6月至5歲的肺炎兒童的誘導(dǎo)痰菌群豐度前5位依次為鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、巴斯德氏菌屬、普氏菌屬和韋榮球菌屬［9］，健康成人BALF菌群豐度前5位依次為普氏菌屬、鏈球菌屬、奈瑟菌屬、巴斯德氏菌屬和梭桿菌屬［13］，本研究中肺炎患兒肺部菌群中假單胞菌屬、克雷伯菌屬和羅氏菌屬豐度增加，假單胞菌屬(變形菌門)在肺部占73．06%，普氏菌屬、鏈球菌屬和奈瑟菌屬的豐度降低。

既往研究報(bào)道假單胞菌屬是最不易受抗生素影響的菌屬之一［14］，本研究嬰兒的呼吸道中假單胞菌豐富度較高，可能患兒病程長(zhǎng)、抗生素大量使用，對(duì)抗生素敏感的菌群被抑制有關(guān)。有研究顯示，慢性呼吸系統(tǒng)疾病如COPD患者急性發(fā)作期的下呼吸道菌群以變形菌門為主，哮喘的急性發(fā)作也伴有變形菌門含量增加［15］;HIV患者BALF菌群變形菌門增加［16］。這種相似的菌群變化是疾病發(fā)生發(fā)展的因素還是治療所致?生命早期的菌群改變對(duì)呼吸系統(tǒng)預(yù)后的影響如何?尚需更深入的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，咽拭子與BALF中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌均為共有菌，占菌群的98%以上。除假單胞菌屬、鏈球菌屬和羅氏菌屬外，其他共有菌在上、下呼吸道中的相對(duì)含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果提示，上呼吸道菌群可在一定程度反映下呼吸道菌群，為通過(guò)上呼吸道菌群研究分析下呼吸道菌群的作用提供了理論依據(jù)。與上呼吸道菌群比較，＜6個(gè)月肺炎嬰兒的BALF有較多的獨(dú)有菌，菌群豐富度高于上呼吸道，而多樣性低于上呼吸道。這與既往對(duì)于上、下呼吸道菌群的比較結(jié)果略有不同，Bassis等［13］報(bào)告，健康成人的上呼吸道菌群的豐富度及多樣性均高于下呼吸道;Marsh等［8］的研究顯示，慢性肺病(遷延性細(xì)菌性支氣管炎和慢性化膿性肺疾病)患兒的口咽拭子菌群豐富度及多樣性高于支氣管BALF菌群;Pittman等［17］對(duì)囊性纖維化的小嬰兒的BALF及口咽拭子菌群的研究顯示，肺部菌群多樣性高于口咽部;國(guó)內(nèi)學(xué)者［18］對(duì)成人肺占位性疾病患者的研究顯示，肺部菌群的多樣性及豐富度均高于口腔。上、下呼吸道菌群的狀態(tài)可能受年齡、疾病狀態(tài)、地域環(huán)境及治療手段等多種因素的影響，這種菌群狀況在疾病中的作用仍不清楚。

本文研究對(duì)象在標(biāo)本采集前均已接受了抗生素治療，會(huì)對(duì)上、下呼吸道菌群產(chǎn)生影響，無(wú)法真實(shí)反映肺炎患兒上、下呼吸道菌群的狀況，也不能反映引起肺炎的菌群是來(lái)自于定植菌還是外來(lái)菌。依照倫理和現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)手段，診斷為肺炎患兒，幾乎不存在沒(méi)經(jīng)過(guò)抗生素治療狀況下，可以采集到下呼吸道標(biāo)本的可能。然而抗生素使用是非病毒性肺炎的主要治療手段，抗生素治療背景下的菌群也可一定程度反映肺炎患兒的菌群狀況。

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