劉文靜 何斌 張倬華 張燕婷 程初勇 黃照河

【關(guān)鍵詞】 Toll樣受體4;基因多態(tài)性;廣西

中圖分類號：R394.5?? 文獻標識碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.01.002

A study of genetic polymorphism of Toll-like receptor 4 at promoter region in Zhuang and Han population in Guangxi

LIU Wenjing1，HE Bin，ZHANG Zhuohua，ZHANG Yanting，CHENG Chuyong，HUANG Zhaohe

【Abstract】 Objective To investigate the distribution of polymorphisms of rs10116253C/T and rs10983755G/A loci of Toll-like receptor 4（TLR4） at promoter region in Zhuang and Han population in Guangxi，and to explore their differences among various regions and groups.

Methods Snapshot SNPs genotyping assays and DNA sequencing methods were used to detect genotype and allele of rs10116253C/T and rs10983755G/A loci in TLR4 gene promoter region among 123 healthy cases in Zhuang and Han population in Guangxi，and the distribution difference of genotype and allele frequency between Hapmap-HCB，Hapmap-JPT，Hapmap-CEU and Hapmap-YRI was compared and analyzed.

Results Three genotypes（CC，CT and TT） were found in rs10116253C/T of TLR4 gene at promoter region in Zhuang and Han? population in Guangxi with the frequency of 13.82%，44.72% and 41.46% respectively，difference of the three genotypes was statistically significant between genders in Guangxi population（P<0.05）.However，there was no statistically significant difference in each allele between different genders in Guangxi population（P>0.05）.Difference of genotype and allele frequencies of rs10116253C/T between Guangxi population and Hapmap-CEU was statistically significant（P<0.05）.Three genotypes（AA，AG and GG） were found in rs10983755G/A with the frequency of 4.07%，32.52% and 63.41%，respectively.There was no statistically significant difference in each genotype and allele between different genders in Guangxi population（P>0.05），but difference of genotype and allele distribution frequencies rs10983755G/A between Guangxi population and Hapmap-CEU and Hapmap-YRI was statistically significant（P<0.001）.

Conclusion The polymorphisms of TLR4 gene rs10116253C/T and rs10983755G/A at promoter region are different in various regions and ethnic groups.

【Key words】 TLR4;gene polymorphism;Guangxi

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）蛋白被確認為基因家族中相對保守的跨膜受體之一，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白受體，是人類天然性免疫家族中的基本成員之一，并在免疫調(diào)節(jié)及炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1～2]。隨著分子生物學(xué)水平的進步和基因組學(xué)技術(shù)的研究，作為TLRs家族中重要的成員之一的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），其多態(tài)性對疾病的影響也逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者們的關(guān)注，多項研究證實TLR4基因多個位點（如rs11536889、rs4986790、rs4986791、rs1927911、rs10759932等）具有多態(tài)性，與感染[3]、腫瘤[4]、自身免疫性疾病[5]、冠心病[6]等多種疾病的易感性及預(yù)后密切相關(guān)。但基因多態(tài)性受地區(qū)、人種及環(huán)境等方面因素的影響，故本研究擬探討廣西壯族和漢族健康人群TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253C/T、rs10983755G/A位點單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）的分布特點，同時與不同地區(qū)、不同種族人群比較，旨在分析基因多態(tài)性在不同地區(qū)、不同種族中的分布差異，為與TLR4基因有關(guān)疾病的遺傳學(xué)規(guī)律及治療等方面的研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢的健康人群123例，其中男性78例，女性45例，壯族80例，漢族43例，年齡38～84（59.09±9.95）歲，所有入選對象臨床和實驗室檢查指標等均在正常范圍內(nèi)，彼此之間無血緣關(guān)系，且三代直系親屬均為壯族或漢族，出生并長期居住于廣西地區(qū)。據(jù)知情同意原則，本研究所有研究對象均簽署知情同意書，并經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 DNA制備

所有入選對象采血前夜22：00后禁食，于早上6：00～7：00抽取靜脈血約2 ml，置于含有乙二胺四乙酸三鉀（Ethylene Diamine Tetraacaetic Acidtripotassium，EDTA-K3）抗凝的采血管中，立即顛倒混勻，采用DNA血液提取試劑盒提取外周血基因組 DNA（全血基因組 DNA試劑盒購自北京天根生化科技有限公司），提取后的DNA檢測其濃度，達標后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與合成

TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A的序列來自NCBI GenBank，引物采用Primer3軟件（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。TLR4基因rs10116253C/T上游引物序列：5-TCAGAGGAAGGGCTCTGGATTG-3;下游引物序列：5-TCCCTGGAAAGTTAATGGTGTTTCA-3;延伸引物序列：5 -TTTTTTTTTTTGATGTTCTGGCATCTGGGAAG-3;rs10983755G/A上游引物：5-CCACAAAATGGTCCCTCACAGC-3，下游引物：5-TGGGATTAAATGAACTGGCATTTG-3，延伸引物：5-TTTCCTCACAGCTTGGTTTTTGACAC-3。

1.2.3 PCR反應(yīng)和基因測序

PCR反應(yīng)體系（10 μL）包括：1GC-I buffer（Takara），3.0 mM Mg2+N，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc.），1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循環(huán)程序：95℃預(yù)變性 2 min，94℃變性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，重復(fù)11個循環(huán);然后94℃變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，重復(fù)24個循環(huán);72℃延伸2 min，產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆?。?0 μL PCR產(chǎn)物，加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶純化后進行SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)，取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物上ABI3730XL測序儀，ABI3730XL測序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1（AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA）來分析（由上海天昊生物科技有限公司協(xié)助完成）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗采用Haplo View4.0軟件檢驗群體代表性。各位點基因型和等位基因頻率采用直接計數(shù)法，采用χ2檢驗或按Fishers確切概率法比較各組間基因型和等位基因頻率分布的差異。檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)? 果

2.1 廣西人群TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A位點的分型

Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，結(jié)果顯示兩位點基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明所選樣本具有群體代表性。rs10116253C/T、rs10983755G/A位點均存在基因多態(tài)性，rs10116253C/T位點存在CC、CT、TT三種基因型，rs10983755G/A位點存在GG、GA、AA三種基因型，具體基因測序驗證結(jié)果詳見圖1、圖2。

2.2 TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A位點多態(tài)性在廣西人群中的分布

rs10116253C/T位點的CC、CT、TT三種基因型在廣西地區(qū)男女之間相比，其頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），C、T兩種等位基因在廣西地區(qū)男女之間相比，其頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;rs10983755G/A位點的GG、GA、AA三種基因型和G、A兩種等位基因在廣西地區(qū)男女之間相比，其頻率分布的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1? 。

2.3 廣西人群TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A位點多態(tài)性與其他地區(qū)人群比較

參考人類基因組計劃（Hapmap）公布的非洲人、歐洲人、日本人、北京人的TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253C/T、rs10983755G/A位點SNP分型的數(shù)據(jù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），比較廣西地區(qū)壯族和漢族人群TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253C/T、rs10983755G/A共2個多態(tài)性位點基因型和等位基因頻率分布在不同地區(qū)、不同種族人群間的差異，得出中國廣西人群與上述四種人群TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A位點基因型及等位基因頻率的總體分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，中國廣西人群rs10116253C/T位點基因型及等位基因分布頻率與中國北京、日本、非洲人群比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與歐洲人群相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。中國廣西人群rs10983755G/A位點基因型及等位基因分布頻率與中國北京、日本人群比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與歐洲、非洲人群相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見表3。

3 討? 論

跨膜蛋白TLR4是TLRs中的高度保守蛋白之一，其不僅是免疫炎性反應(yīng)過程中的關(guān)鍵受體，同時還是其信號傳導(dǎo)途徑中的起始蛋白，通過識別機體自身或外來分子，誘導(dǎo)炎性介質(zhì)、黏附分子等物質(zhì)的生成與釋放或表達上調(diào)，從而引起機體自身的免疫炎性反應(yīng)[1～2，7]，參與感染[8]、冠心病[9]、腫瘤[10]、自身免疫性疾病[11]等疾病的發(fā)生發(fā)展。

人類TLR4基因位于第9號染色體長臂上（9q32-q33），經(jīng)人類基因組計劃掃描發(fā)現(xiàn)TLR4基因存在著變異及多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因存在多個多態(tài)性位點，與多種疾病的發(fā)生風(fēng)險相關(guān)，Proenca等[12]研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因rs4986790A/G多態(tài)性與巴西人群結(jié)直腸癌患者的發(fā)生無明顯相關(guān)性，國內(nèi)柴利等人[13]的研究也同樣發(fā)現(xiàn)中國漢族人群中rs4986790A/G多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生無明顯相關(guān)性，與前面學(xué)者的研究結(jié)果一致。但Pimentel-Nunes等[14]在歐洲人群的研究中發(fā)現(xiàn)，rs4986790A/G位點多態(tài)性與歐洲人群結(jié)直腸癌的發(fā)病有相關(guān)性，攜帶純合子基因型可能使歐洲人群結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險升高，與Proenca及柴利等學(xué)者的研究結(jié)果不一致，因此，準確分析TLR4基因多態(tài)性在不同地區(qū)、不同種族健康人群中的分布規(guī)律尤為重要，將為研究不同地區(qū)、不同種族人群TLR4基因多態(tài)性和相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系提供遺傳學(xué)規(guī)律及理論參考依據(jù)。

廣西位于中國西南地區(qū)，為多民族共同聚居地，其中，壯族是最主要的民族，其次為漢族人群。本實驗研究采用單堿基延伸PCR技術(shù)及DNA測序方法檢測廣西地區(qū)壯族和漢族健康人群TLR4基因rs10116253C/T、rs10983755G/A 兩個位點多態(tài)性的分布特點，同時與不同人群比較，分析不同人群TLR4基因SNP的多態(tài)性分布情況。結(jié)果顯示，rs10116253C/T位點以CT+TT基因型（44.72%+41.46%）及T等位基因（63.82%）的頻率較高，其基因型頻率在廣西地區(qū)男、女之間相比差異顯著（P<0.05），與Hapmap公布的4個人群（非洲人、歐洲人、日本人、北京人）的頻率趨勢相近，但其相對的頻率分布在不同地區(qū)、不同人群有顯著差異;同樣，rs10983755G/A位點以GG基因型（63.41%）及G等位基因（79.67%）的頻率較高，與Hapmap公布的4個人群（非洲人、歐洲人、日本人、北京人）的頻率趨勢也相近，但其相對的頻率分布在不同地區(qū)、不同人群也有顯著差異。Castano-Rodriguez等[15]針對中國人群的研究發(fā)現(xiàn)，rs10116253C/T位點多態(tài)性與中國人群胃癌的發(fā)生無明顯相關(guān)性，但對中國東北地區(qū)人群的一項研究發(fā)現(xiàn)，攜帶CC基因型能夠預(yù)示患病風(fēng)險降低[16]，與前者的研究結(jié)果不同;Kim等[17]研究顯示，rs10983755A/G位點多態(tài)性與韓國人群胃癌的發(fā)病有相關(guān)性，攜帶等位基因A較攜帶等位基因G的純合子患病風(fēng)險明顯升高，但對中國東北地區(qū)人群的一項研究發(fā)現(xiàn)，攜帶AG或AA基因型較攜帶GG純合子基因型的患病風(fēng)險降低[18]，與針對韓國人群的研究結(jié)果相反。本實驗的研究結(jié)果表明，不同地區(qū)、不同種族人群間同一基因位點的基因型及等位基因分布頻率不同，而同一種族、同一地區(qū)的不同人群也有差異，但差異較小，不同基因位點在不同地區(qū)、不同種族人群中的分布差異不一致。本研究中，廣西人、北京人、日本人均屬于亞洲人群，親緣關(guān)系較近，多態(tài)性分布趨勢相似，廣西人與非洲人、歐洲人親緣關(guān)系較遠，其基因多態(tài)性的分布趨勢差異較大，造成這種差異的主要原因與各人群的遺傳背景差異有關(guān)，此外還與不同地區(qū)的生活習(xí)慣及環(huán)境等多方面的因素有關(guān)。

綜上所述，廣西地區(qū)壯族和漢族人群TLR4基因啟動子區(qū)rs10116253C/T、rs10983755G/A位點多態(tài)性在不同的人群和地區(qū)之間存在差異。分析不同地區(qū)、不同人群TLR4基因多態(tài)性的分布差異，給我們更進一步了解群體遺傳學(xué)的認識提供幫助，為今后闡明廣西地區(qū)TLR4基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展間的聯(lián)系提供參考依據(jù)，為臨床上后續(xù)研究不同地區(qū)、不同種族人群在相關(guān)疾病發(fā)生機制上的差異，以及相關(guān)疾病從基因水平的靶向治療和評估發(fā)病風(fēng)險提供新的理論依據(jù)。

參 考 文 獻

[1] Lee BL，Barton GM.Trafficking of endosomal Toll-like receptors[J].Trends Cell Biol，2014，24（6）：360-369.

[2] Akira S，Uematsu S，Takeuchi O.Pathogen recognition and innate immunity[J].Cell，2006，124（4）：783-801.

[3] Loganathan R，Nazeer M，Goda V，et al.Genetic variants of TLR4 and TLR9 are risk factors for chronic Helicobacter pylori infection in South Indian Tamils[J].Hum Immunol，2017，78（2）：216-220.

[4] Semlali A，Jalouli M，Parine NR，et al.Toll-like receptor 4 as a predictor of clinical outcomes of estrogen receptor-negative breast cancer in Saudi women[J].Onco Targets Ther，2017，10： 1207-1216.

[5] Rupasree Y，Naushad SM，Rajasekhar L，et al.Association of TLR4 （D299G，T399I），TLR9-1486T>C，TIRAP S180L and TNF-alpha promoter （-1031，-863，-857） polymorphisms with risk for systemic lupus erythematosus among South Indians[J].Lupus，2015，24（1）：50-57.

[6] 孫丹丹，吳玉鵬，楊 軍，等.Toll樣受體-4基因啟動子區(qū)多態(tài)性與急性心肌梗死發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥，2017，57（17）： 17-20.

[7] Erridge C.Endogenous ligands of TLR2 and TLR4： agonists or assistants？[J].J Leukoc Biol，2010，87（6）： 989-999.

[8] Mukherjee S，Karmakar S，Babu SP.TLR2 and TLR4 mediated host immune responses in major infectious diseases：a review[J].Braz J Infect Dis，2016，20（2）：193-204.

[9] Jia SJ，Niu PP，Cong JZ，et al.TLR4 signaling：a potential therapeutic target in ischemic coronary artery disease[J].Int Immunopharmacol，2014，23（1）：54-59.

[10] Wang X，Yu X，Wang Q，et al.Expression and clinical significance of SATB1 and TLR4 in breast cancer[J].Oncol Lett，2017，14（3）：3611-3615.

[11] Liu Y，Yin H，Zhao M，et al.TLR2 and TLR4 in autoimmune diseases：a comprehensive review[J].Clin Rev Allergy Immunol，2014，47（2）：136-147.

[12] Proenca MA，de Oliveira JG，Cadamuro AC，et al.TLR2 and TLR4 polymorphisms influence mRNA and protein expression in colorectal cancer[J].World J Gastroenterol，2015，21（25）： 7730-7741.

[13] 柴 利，黃 娟，陳 明，等.TLR基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性[J].重慶醫(yī)學(xué)，2016，45（30）： 4214-4216.

[14] Pimentel-Nunes P，Teixeira AL，Pereira C，et al.Functional polymorphisms of Toll-like receptors 2 and 4 alter the risk for colorectal carcinoma in Europeans[J].Dig Liver Dis，2013，45（1）：63-69.

[15] Castano-Rodriguez N，Kaakoush NO，Pardo AL，et al.Genetic polymorphisms in the Toll-like receptor signalling pathway in Helicobacter pylori infection and related gastric cancer[J].Hum Immunol，2014，75（8）：808-815.

[16] Huang L，Yuan K，Liu J，et al.Polymorphisms of the TLR4 gene and risk of gastric cancer[J].Gene，2014，537（1）：46-50.

[17] Kim J，Cho YA，Choi IJ，et al.Effects of polymorphisms of innate immunity genes and environmental factors on the risk of noncardia gastric cancer[J].Cancer Res Treat，2013，45（4）：313-324.

[18] Li P，He CY，Xu Q，et al.Effect of the-2081G/A polymorphism of the TLR4 gene and its interaction with Helicobacter pylori infection on the risk of gastric cancer in Chinese individuals[J].Genet Test Mol Biomarkers，2014，18（9）：610-615.