李玉苓，郭文征，張衛(wèi)民，孫韜，趙彩彥

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前世界上第五大常見(jiàn)腫瘤，位列癌癥死亡原因的第2位，每年約有一百萬(wàn)人死于HCC[1]。另外，HCC具有發(fā)病隱匿、生物惡性程度高、生存期短及對(duì)放、化療均不敏感等特點(diǎn)，預(yù)后差，目前臨床治療不樂(lè)觀。近年來(lái)，維生素D（ vitamin D，VD）的抗腫瘤作用日益受到重視[2]。研究發(fā)現(xiàn)，維生素D可發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡和分化等抗腫瘤作用[3]。維生素D生物學(xué)效應(yīng)主要由細(xì)胞內(nèi)特異性的維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）介導(dǎo)。本研究通過(guò)檢測(cè)HCC患者肝癌組織及其癌旁組織VDR mRNA水平及其VDR蛋白表達(dá)，并與正常肝臟組織比較，以探討維生素D在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年3月～2014年11月就診于河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院接受肝移植的HCC患者10例（均有乙型肝炎肝硬化基礎(chǔ)），男7例，女3例；年齡28～72歲，平均年齡（44.3±11.2）歲。診斷符合2011年版《原發(fā)性肝癌診治規(guī)范》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，分別取HCC患者癌組織及其癌旁組織。所有HCC患者血清HBsAg陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并甲型、丙型、丁型、戊型肝炎病毒、EBV、CMV、HIV 感染；（2）伴有酒精性肝病、自身免疫性疾病、藥物性肝損傷、心血管疾??；（3）妊娠；（4）其它系統(tǒng)嚴(yán)重疾病患者。另外選取同期肝移植供體4例，男3例，女1例；年齡20～56歲，平均年齡（31.5±11.7）歲，分別取其正常肝組織。

1.2 肝組織VDR檢測(cè) 采用Power Vision TM二步免疫組化法檢測(cè)肝臟組織VDR表達(dá)。主要步驟如下：（1）脫蠟；（2）抗原修復(fù)；（3）在切片上加 3%H2O2，于37℃溫育箱中孵育15 min，以封閉非特異性抗原，PBS緩沖液洗5 min×2次；（4）滴加兔抗人VDR多克隆抗體，置于冰箱中4℃過(guò)夜，室溫下復(fù)溫30 min，加0.01 M PBS緩沖液洗5 min×2次；（5）滴加山羊抗兔IgG，置于37℃孵育40 min，加0.01 M PBS 緩沖液洗 5 min×2次；（6）加 3，3'- 二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-Diaminobenzidine，DAB）顯色，時(shí)間約1 min；（7）自來(lái)水沖洗，終止顯色，加蘇木素復(fù)染，時(shí)間約為2 min，在分化液中浸泡30 s，再在返藍(lán)液中浸泡30 s，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，晾干后在顯微鏡下觀察結(jié)果，細(xì)胞被染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3 肝組織VDR mRNA水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（美國(guó)Invitrogen公司Trizol試劑），提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在Taq DNA聚合酶作用下合成PCR產(chǎn)物。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）作為內(nèi)參照基因。GAPDH 上游引物：5’-AACAGCCTCAAGATCAGCAA-3’， 下 游 引 物 ：5’-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 149 bp；VDR 上游引物：5’-ACCAGAAGCCTTT GGGTCTG-3’，下游引物：5’-CGTTCCGGTCAAAG TCTCCA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度110 bp。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min，進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，95℃變性15 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)待測(cè)基因與管家基因的Ct值，用 RQ 值（2-ΔΔCt）表示待測(cè)基因的相對(duì)水平[3]。

1.4 肝組織VDR蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，兔抗人VDR多克隆抗體購(gòu)于艾菲生物技術(shù)有限公司（Catalog：AF6159），抗 GAPDH 抗體購(gòu)于美國(guó)Bioworld公司。提取肝組織蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，先后加一抗、二抗，行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)、曝光、顯影，掃描圖片。應(yīng)用Image J軟件測(cè)定各條帶灰度值，以計(jì)算VDR蛋白與GAPDH灰度比值作為VDR蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（±s）表示，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。對(duì)正態(tài)分布資料，采用單因素方差分析，組間比較采用 Student-Newman-Keuls法檢驗(yàn)，對(duì)非正態(tài)分布資料，采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用Pearson直線相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織VDR蛋白表達(dá)情況 VDR在所有HCC患者的癌組織及正常肝臟組織均表達(dá)，主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，細(xì)胞核中基本無(wú)表達(dá)（圖1和圖2）。

圖1 正常肝組織VDR表達(dá)情況（Power Vision TM，200×）

圖2 肝癌組織VDR表達(dá)情況 （Power Vision TM，400×）

2.2 肝組織VDR mRNA及其蛋白水平比較 10例癌組織VDR mRNA水平為（2.77±0.30），顯著高于癌旁肝硬化組織（1.62±0.21）或正常肝組織（1.57±0.19），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖 3）；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，HCC組織VDR蛋白表達(dá)水平（1.15±0.57）顯著高于癌旁肝硬化組織（1.02±0.25）或正常肝臟組織（0.37±0.11），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖 4）。

圖3 各組肝組織VDR mRNA水平比較

圖4 各組肝組織VDR蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

VDR是類(lèi)固醇激素／甲狀腺激素受體超家族成員，分為膜受體（menbrance vitamin D receptor，mVDR）和核受體（nuclear vitamin D receptor，nVDR）兩類(lèi)。膜受體主要負(fù)責(zé)維持鈣磷平衡，而核受體本質(zhì)是一種配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與活性維生素D3結(jié)合形成激素-受體復(fù)合物，該復(fù)合物與相應(yīng)目的基因啟動(dòng)子區(qū)域的作用元件結(jié)合，從而啟動(dòng)或抑制該基因的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，影響組織細(xì)胞增殖分化及其相應(yīng)的生物學(xué)功能，這是維生素D發(fā)揮作用的基因途徑。維生素D生物學(xué)作用還有非基因途徑，主要表現(xiàn)有以下幾方面：促使胰島B細(xì)胞分泌胰島素，調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞對(duì)鈣離子的吸收，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中電壓門(mén)控的鈣離子和氯離子通道的開(kāi)放以及內(nèi)皮細(xì)胞的遷移等。

腫瘤形成是一個(gè)復(fù)雜的多因素作用的過(guò)程，主要由環(huán)境因素和基因特性決定[4]。維生素D抗腫瘤已證實(shí)的機(jī)制主要有以下幾方面：（1）調(diào)控細(xì)胞周期：腫瘤是一類(lèi)細(xì)胞周期疾病，細(xì)胞周期的失控是影響細(xì)胞惡變的重要因素，維生素D可以將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，導(dǎo)致S期細(xì)胞數(shù)目下降，致使G0～G1期細(xì)胞堆積，而G2～M期的細(xì)胞數(shù)目相對(duì)無(wú)變化[5]，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖；（2）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞調(diào)亡是調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生長(zhǎng)和分裂的重要過(guò)程，與細(xì)胞周期密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)脂肪酸輔酶A連接酶（fatty acid coaligase，F(xiàn)ACL）屬于脂酸代謝酶家族，F(xiàn)ACL可促進(jìn)花生四烯酸等長(zhǎng)鏈脂酸形成脂酸輔酶A，而花生四烯酸輔酶A可通過(guò)激活Caspase-3通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且由于花生四烯酸的堆積，會(huì)抑制這種促凋亡作用，以至于停止，因此過(guò)度表達(dá)的FACL可以降低細(xì)胞內(nèi)花生四烯酸水平，從而阻止促凋亡作用[6]；（3）影響生長(zhǎng)因子和激素：1,25（OH）2D3及其類(lèi)似物與VDR結(jié)合，形成激素-受體復(fù)合物，該復(fù)合物作用于靶基因，上調(diào)類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor binding proteins，IGFBPs）表達(dá)，從而降低了類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor IGF）活性，阻斷IGF促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用[7]，達(dá)到抗腫瘤目的；（4）抑制端粒酶的活性：1,25（OH）2D3 可以明顯降低端粒酶的活性，影響腫瘤細(xì)胞周期[8]，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用。另外，端粒酶活性的降低能進(jìn)一步協(xié)同1,25（OH）2D3對(duì)HCC細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用；（5）非基因途徑：核轉(zhuǎn)錄因子p65可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基質(zhì)金屬蛋白酶是作用于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的蛋白水解酶。盛茂林等[9]發(fā)現(xiàn)維生素D類(lèi)似物EB1089發(fā)揮抗腫瘤作用是通過(guò)非基因途徑的雌激素受體α（estrogen receptor，ERα）介導(dǎo)，主要表現(xiàn)為下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子p65（nuclear transcription factor p65，NF-κB p65）和基質(zhì)金屬蛋白酶 -9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）表達(dá)，從而影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，并且抑制其侵襲轉(zhuǎn)移。另外，DNA損傷及抗氧化酶活性降低可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，維生素D可以通過(guò)阻止DNA損傷、恢復(fù)抗氧化酶活性來(lái)抑制腫瘤的產(chǎn)生[10]。自吞噬是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)容物降解和再循環(huán)的過(guò)程，可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。維生素D還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自吞噬[11]，而自吞噬基因編碼的蛋白Beclin-1又能增強(qiáng)維生素D誘導(dǎo)的自吞噬作用[12]，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

維生素D抗腫瘤作用的發(fā)揮主要是通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)的VDR結(jié)合實(shí)現(xiàn)。多項(xiàng)研究表明維生素D對(duì)許多組織細(xì)胞VDR蛋白有上調(diào)作用，但是在VDR mRNA水平的調(diào)節(jié)卻比較復(fù)雜，既可以表現(xiàn)為向上調(diào)節(jié)，也可以無(wú)調(diào)節(jié)作用，對(duì)于部分細(xì)胞甚至可以產(chǎn)生下調(diào)作用，具有明顯的組織細(xì)胞特異性[13]。VDR屬于類(lèi)固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員，廣泛分布于機(jī)體各組織細(xì)胞中，比如癌變的乳腺、垂體、甲狀旁腺等部位[14]。不同癌組織VDR表達(dá)是有差異的，但目前對(duì)腫瘤組織VDR表達(dá)水平的意見(jiàn)還未達(dá)成一致。關(guān)于VDR在癌組織中表達(dá)的研究主要集中在乳腺癌和結(jié)腸癌。Ditsch et al[15]研究納入82例乳腺癌患者，分析發(fā)現(xiàn)VDR高表達(dá)患者與VDR低表達(dá)者比，具有更長(zhǎng)的整體生存期和無(wú)惡化生存期。然而，Eisman[16]研究報(bào)道乳腺癌組織VDR表達(dá)與正常乳腺組織無(wú)明顯差異，并且發(fā)現(xiàn)約80%乳腺癌組織細(xì)胞核中都有VDR表達(dá)。檢測(cè)結(jié)腸癌組織VDR時(shí)發(fā)現(xiàn)，癌組織VDR陽(yáng)性率為32%，正常粘膜組織為89%[17]。VDR在正常粘膜組織的表達(dá)明顯高于癌組織，并且VDR均表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。最近的研究發(fā)現(xiàn)VDR除存在于細(xì)胞核內(nèi)，在某些細(xì)胞還存在于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中[18]。也有研究者先后在多種肝癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)VDR表達(dá)[19]，提示肝癌細(xì)胞可能是維生素D和VDR作用的靶細(xì)胞，VDR基因可能是肝癌的易感基因。研究發(fā)現(xiàn)與正常肝臟組織比，HCC組織VDR表達(dá)增強(qiáng)[20]。在本研究中，我們對(duì)HCC組織、癌旁組織和正常肝組織VDR的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它們均有VDR表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，而細(xì)胞核內(nèi)無(wú)表達(dá)，提示維生素D可以不通過(guò)nVDR影響HCC的發(fā)生發(fā)展，表明維生素D對(duì)HCC可能存在非基因途徑，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)顯示，癌組織VDR mRNA水平明顯高于癌旁組織或正常肝臟組織，HCC組織VDR蛋白表達(dá)也強(qiáng)于癌旁組織或正常肝臟組織。根據(jù)HCC組織、癌旁組織和正常肝組織VDR mRNA及其VDR蛋白表達(dá)的差異，推測(cè)VDR與HCC的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系。然而，VDR升高是發(fā)生在腫瘤之前，還是腫瘤發(fā)生后導(dǎo)致VDR的升高，還需要進(jìn)一步研究。

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