周開梅，袁森輔，吳 晶，沈祥林

(1.宜賓市第一人民醫(yī)院病理科，四川 宜賓 644000；2.宜賓市第一人民醫(yī)院婦科，四川 宜賓 644000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是原發(fā)于子宮內(nèi)膜的一種上皮性惡性腫瘤，可發(fā)生于各年齡段女性，尤以圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性居多。由于EC早期診斷率較低，導(dǎo)致大部分患者預(yù)后不良，病死率較高。因此，提高EC早期診斷的敏感性和準(zhǔn)確性是改善患者預(yù)后的重要措施[1]。腫瘤標(biāo)志物檢測是腫瘤患者的一項(xiàng)重要檢查，對腫瘤診斷、病情評估、個(gè)體化治療及預(yù)后判斷均有較大的意義[2]。糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)是目前EC檢查常用的腫瘤標(biāo)志物，約11%～33%的EC患者血清CA125水平升高[3]。人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一種新型腫瘤標(biāo)志物，是迄今為止最敏感最準(zhǔn)確的EC標(biāo)志物[4]。目前，對于CA125和HE4的研究多聚焦在血清水平，關(guān)于二者在腫瘤組織中表達(dá)的研究較少[5-6]。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測EC組織及癌旁組織中HE4和CA125的表達(dá)，旨在從分子水平探討二者與EC發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2015年12月至2016年12月宜賓市第一人民醫(yī)院婦科收治的EC患者35例，年齡36～72(48.4±9.1)歲，<60歲26例，≥60歲9例；病理類型：子宮內(nèi)膜樣腺癌21例，透明細(xì)胞癌5例，漿液性乳頭樣腺癌9例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(federation international of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO)分期[7]：Ⅰ期6例，Ⅱ期9例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例；組織分化程度：低分化6例，中分化12例，高分化17例；腫瘤直徑：<2 cm者18例，≥2 cm者17例；肌層浸潤深度：<1/2者17例，≥1/2者18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。所有患者術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診為EC，術(shù)前未接受過放射治療、化學(xué)治療及激素治療。

1.2主要試劑與儀器鼠抗人CA125單克隆抗體、鼠抗人HE4單克隆抗體及堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素法檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；HH-ZKS4電熱恒溫水浴箱(上?？粕齼x器有限公司)，BD-200光學(xué)顯微鏡(深圳博士達(dá)光學(xué)儀器有限公司)。

1.3免疫組織化學(xué)法檢測EC組織及癌旁組織中HE4和CA125表達(dá)術(shù)中留取新鮮EC組織和癌旁組織，使用40 g·L-1多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，展片，烤片；常規(guī)脫蠟和水化；正常羊血清工作液封閉，室溫下孵育10～20 min；棄去封閉液，勿洗；滴加一定比例稀釋后的一抗(鼠抗人CA125單克隆抗體、鼠抗人HE4單克隆抗體)，4 ℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次，每次3 min；滴加適量(10～30 μL)生物素標(biāo)記二抗工作液，37 ℃孵育10～15 min；PBS洗3次，每次 3 min；滴加適量(10～30 μL)堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37 ℃孵育10～15 min；PBS洗3次，每次3 min；滴加堿性磷酸酶顯色劑30～50 μL，室溫下顯色30 min。顯微鏡下觀察，待陽性部位出現(xiàn)紅色標(biāo)記物時(shí)，用PBS洗滌3次，每次3 min；滴加細(xì)胞核復(fù)染液30～50 μL，5～10 s后自來水洗滌；水溶性封片劑封片，鏡檢。

1.4結(jié)果判定HE4主要定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性表達(dá)為腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F(tuán)塊，CA125主要定位于細(xì)胞膜，陽性表達(dá)為細(xì)胞膜被染成棕黃色。每個(gè)病例選5張切片，光學(xué)顯微鏡400倍視野下，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，根據(jù)瘤細(xì)胞顯色程度及顯色細(xì)胞比例進(jìn)行評分。顯色程度評分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。顯色細(xì)胞比例評分：顯色細(xì)胞占1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。綜合評分=顯色程度評分×顯色細(xì)胞比例評分，綜合評分：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～6分為中等陽性(++)，>6分為強(qiáng)陽性(+++)。陽性率=(弱陽性+中等陽性+強(qiáng)陽性)/總例數(shù)×100%。所有病理切片均由3位病理科醫(yī)師輪流閱片評定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EC組織及癌旁組織中HE4和CA125的表達(dá)結(jié)果見圖1、圖2和表1。HE4、CA125陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒，呈點(diǎn)、片狀分布于子宮內(nèi)膜細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)；EC組織中HE4和CA125陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.831、25.533，P<0.05)。

A：CA125在EC組織中的陽性表達(dá)；B：CA125在EC組織中的陰性表達(dá)；C：CA125在癌旁組織中的陽性表達(dá)；D：CA125在癌旁組織中的陰性表達(dá)。

圖1EC組織及癌旁組織中CA125的表達(dá)

Fig.1ExpressionofCA125inECandparacanceroustissues

A：HE4在EC組織中的陽性表達(dá)；B：HE4在EC組織中的陰性表達(dá)；C：HE4在癌旁組織中的陽性表達(dá)；D：HE4在癌旁組織中的陰性表達(dá)。

圖2EC組織及癌旁組織中HE4的表達(dá)

Fig.2ExpressionofHE4inECandparacanceroustissues

表1EC組織及癌旁組織中HE4和CA125表達(dá)比較

Tab.1ComparisonoftheexpressionofHE4andCA125inECandparacanceroustissues

組織類型nHE4表達(dá)-/例+/例++/例+++/例陽性率/%CA125-/例+/例++/例+++/例陽性率/%癌旁組織353140011.43050014.3EC組織3565131182.9a9612874.3a

注：與癌旁組織比較aP<0.05。

2.2HE4與CA125表達(dá)與EC臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表2。Ⅲ、Ⅳ期EC組織中HE4、CA125陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期EC組織，中、低分化EC組織中HE4、CA125陽性表達(dá)率顯著高于高分化EC組織，肌層浸潤深度≥1/2的EC組織中HE4、CA125陽性表達(dá)率顯著高于肌層浸潤深度<1/2的EC組織，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC組織中HE4陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EC組織中HE4、CA125的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小及病理類型無顯著相關(guān)性(P>0.05)，EC組織中CA125的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表2HE4與CA125表達(dá)與EC患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.2RelationshipbetweentheexpressionofHE4andCA125andclinicopathologicalfeaturesofECpatients

臨床病理特征nHE4-/例+/例++/例+++/例陽性率/%χ2PCA125-/例+/例++/例+++/例陽性率/%χ2P年齡 <60歲265510680.80.3100.806758673.10.0001.000 ≥60歲9103588.9214277.8FIGO分期 Ⅰ～Ⅱ期15644160.09.6550.003744053.34.2660.039 Ⅲ～Ⅳ期2001910100.0228890.0組織分化程度 高分化17653364.77.6670.008754158.84.1370.042 中、低分化1800108100.0218788.9腫瘤大小 <2cm18446477.80.6730.658746161.13.3670.121 ≥2cm17217788.2226788.2肌層浸潤深度 <1/217633564.77.6670.008825252.97.8840.007 ≥1/21802106100.0147694.4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無16635262.58.5990.005535368.80.4730.700 有190289100.0437578.9病理類型 腺癌21319885.7547576.2 透明細(xì)胞癌50131100.02.8160.245212060.00.6320.729 漿液性乳頭樣腺癌9331266.7213377.8

2.3EC組織中HE4與CA125表達(dá)的關(guān)系Spearman相關(guān)分析顯示，EC組織中HE4表達(dá)與CA125表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.608，P<0.05)。

3 討論

EC是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，占全部婦科惡性腫瘤的20%～30%，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，并且近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%的EC患者可在疾病早期獲得診斷，預(yù)后良好，而晚期及復(fù)發(fā)患者通常預(yù)后較差，病死率較高[9]。因此，提高EC早期診斷率對改善患者預(yù)后具有重要意義。目前，EC的診斷主要依靠影像學(xué)檢查和分段診刮術(shù)，但在早期診斷的敏感性、特異性等方面仍存在不足。腫瘤標(biāo)志物檢測作為一項(xiàng)無創(chuàng)性檢查項(xiàng)目，在腫瘤疾病普查、診斷、治療中得到了廣泛的應(yīng)用[10]。

CA125是一種由體腔上皮細(xì)胞分泌的高分子糖蛋白化合物，是最早被公認(rèn)的理想的血清腫瘤標(biāo)志物，其水平升高對EC的進(jìn)展具有指示意義。但由于在多種經(jīng)上皮細(xì)胞病理性轉(zhuǎn)化而來的組織中均可見CA125表達(dá)增加，使得CA125單項(xiàng)檢測在EC的早期診斷及與良性婦科疾病的鑒別診斷等方面應(yīng)用受限[11]。HE4是一種蛋白酶抑制劑，主要分布于生殖系統(tǒng)上皮細(xì)胞中，在免疫防御及免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用。研究表明，HE4具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長、增強(qiáng)腫瘤侵襲能力的生物特性，被認(rèn)為是EC發(fā)展的致瘤或腫瘤促進(jìn)因素[12]。目前，CA125和HE4的研究主要集中于血清學(xué)層面。臨床研究顯示，EC患者血清CA125和HE4水平均顯著高于良性子宮內(nèi)膜疾病患者及健康女性，表明血清CA125和HE4檢測可用于EC的診斷[13-15]。

本研究結(jié)果顯示，CA125和HE4在EC組織中多為中等至強(qiáng)陽性表達(dá)，且陽性表達(dá)率均顯著高于癌旁組織，提示CA125和HE4高表達(dá)與EC的發(fā)生有關(guān)，HE4可作為高敏感性腫瘤標(biāo)志物，與CA125聯(lián)合檢測用于EC的輔助診斷。本研究對CA125和HE4表達(dá)與EC的臨床病理特征進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示，CA125、HE4均在晚期、深肌層浸潤及中、低分化腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度顯著高于早期、淺肌層浸潤及高分化腫瘤組織，EC組織中CA125和HE4的表達(dá)均與EC的臨床分期、組織分化程度及肌層浸潤深度有關(guān)，但與患者年齡、腫瘤大小及病理類型無關(guān)；這與孫潤蛟等[16]的研究結(jié)果相一致，但也有研究發(fā)現(xiàn)，EC組織中HE4表達(dá)與組織分化程度無關(guān)[17]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，HE4的表達(dá)還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而CA125表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性，提示聯(lián)合檢測CA125與HE4可能提高EC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生的預(yù)測價(jià)值。

綜上所述，CA125和HE4可能與EC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，聯(lián)合檢測CA125和HE4對EC的早期診斷及預(yù)后評估具有重要意義。

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