陳建麗，陳曉文

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)三科，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 524000)

食管癌是全球最致命的疾病之一，其主要病理類型是鱗狀細胞癌，這一病理類型在中國食管癌病例中占90%以上[1-2]。有研究表明，Pim1蛋白在包括食管癌在內(nèi)的多種實體腫瘤中高表達，可促進癌癥發(fā)生[3]，其高表達預(yù)示患者預(yù)后不良[4]。Pim1基因調(diào)控食管癌細胞的增殖、凋亡，Pim1基因所編碼的蛋白在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到關(guān)鍵作用。本研究應(yīng)用免疫組織化學法檢測Pim1蛋白在食管各種病變組織中的表達，分析其與食管癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，旨在為食管癌的早期診斷及預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2009年1月至2016年3月在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院行食管內(nèi)鏡檢查男性患者的食管活檢組織標本182例，其中正常鱗狀上皮組織(距離食管癌組織邊緣2 cm以上，經(jīng)病理證實為正常食管組織)37例，低級別上皮內(nèi)瘤變組織43例，高級別上皮內(nèi)瘤變組織31例，食管鱗狀細胞癌組織71例?；颊吣挲g41～65歲，所有病例經(jīng)病理學檢查確診。

1.2主要試劑與儀器Pim1抗體購于英國Abcam公司，兔單抗(工作濃度1150)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)修復(fù)液購于美國SANTA CRUZ公司，免疫組織化學Envision法試劑盒購于丹麥DaKo公司；高壓修復(fù)鍋購于浙江蘇泊爾股份有限公司，恒溫培養(yǎng)箱購于北京凱元伯樂生物科技有限公司。

1.3免疫組織化學法檢測不同食管組織中Pim1蛋白表達食管組織石蠟切片脫蠟、水化，高壓微波抗原修復(fù)，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DBA)顯色，蘇木精染缸中復(fù)染2 min，依次放入體積分數(shù)70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中各5 min進行脫水處理，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液中各5 min進行透明處理，晾干，中性樹膠封片，最后將石蠟切片置于通風柜，待封片干燥后顯微鏡下觀察。

1.4結(jié)果判定Pim1蛋白定位于細胞核，以細胞核出現(xiàn)黃色顆粒為陽性染色，參考LIU等[4]的判讀標準，綜合考慮陽性細胞百分比及著色強度半定量判定結(jié)果：(1)每例患者隨機觀察5個高倍視野，在無背景著色條件下，細胞核無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)陽性細胞所占比例≤1%為0分，1%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，75%～100%為4分。以陽性細胞百分比得分與著色強度得分的乘積為總得分，

總得分0～2分為陰性(-)，3～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。設(shè)定“-”和“+”為低表達，“++”和“+++”為高表達。

1.5統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，不同食管組織中的Pim1蛋白表達強度比較采用Kruskal-WallisH檢驗，不同食管組織中Pim1蛋白陽性表達率比較采用χ2檢驗，Pim1蛋白陽性表達率與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1Pim1蛋白在不同食管組織中的表達Pim1蛋白在食管正常鱗狀上皮、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變和鱗狀細胞癌組織中的表達呈逐漸升高趨勢(圖1)。食管正常鱗狀上皮、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變和鱗狀細胞癌組織中Pim1蛋白高表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=41.877，P<0.05)。食管低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、鱗狀細胞癌等組織中Pim1蛋白高表達率顯著高于食管正常鱗狀上皮(χ2=11.89、14.79、26.70，P<0.05)，食管低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變及鱗狀細胞癌組織中Pim1蛋白高表達率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；見表1。

A：正常鱗狀上皮；B：低級別上皮內(nèi)瘤變；C：高級別上皮內(nèi)瘤變；D：鱗狀細胞癌。

圖1不同食管組織中Pim1蛋白表達(免疫組織化學Envision法，×200)

Fig.1ExpressionofPim1proteinindifferentesophagealtissues(immunohistochemicalEnvision，×200)

表1Pim1蛋白在食管不同組織中的表達

Tab.1ExpressionofPim1proteinindifferentesophagealtissues

組織類型nPim1蛋白表達-/例(%)+/例(%)++/例(%)+++/例(%)高表達率/%正常鱗狀上皮3723(62.1)5(13.5)8(21.6)1(2.7)24.3低級別上皮內(nèi)瘤變4310(23.2)6(13.9)18(41.9)9(20.9)62.8a高級別上皮內(nèi)瘤變312(6.4)7(22.5)19(61.3)3(9.7)70.9a鱗狀細胞癌7111(15.5)6(8.5)17(23.9)37(52.1)76.1a

注：與正常鱗狀上皮比較aP<0.05。

2.2食管鱗狀細胞癌組織中Pim1蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表2。Pim1蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、組織學分級無關(guān)(P>0.05)。

表2Pim1蛋白表達與食管鱗狀細胞癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

Tab.2CorrelationbetweenexpressionofPim1proteinandclinicopathologicalfeaturesinpatientswithesophagealsquamouscellcarcinoma

臨床病理特征nPim1蛋白低表達/例高表達/例χ2P年齡 <51歲332490.3750.540 ≥51歲38308組織學分級 Ⅰ、Ⅱ級5139120.0170.896 Ⅲ級20155淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無393455.8790.015 有322012TNM分期 Ⅰ、Ⅱ期231494.3090.038 Ⅲ、Ⅳ期48408

3 討論

Pim1在多種實體腫瘤中高表達，是一個促癌基因[2]。LIU等[4]研究發(fā)現(xiàn)，Pim1在食管鱗狀細胞癌中的表達高于食管正常組織，且其高表達預(yù)示著預(yù)后不良。HAN等[5]研究證實，通過沉默Pim1基因可以抑制食管癌細胞增殖，促進細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，食管正常鱗狀上皮、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、鱗狀細胞癌組織中Pim1蛋白表達呈逐漸升高趨勢，提示Pim1在食管癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起促癌基因作用。另外，Pim1蛋白在食管低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、鱗狀細胞癌等組織中的表達顯著高于食管正常鱗狀上皮組織，提示Pim1蛋白可能在食管正常鱗狀上皮向上述3種組織轉(zhuǎn)化的過程中起著重要作用。Pim1蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，提示Pim1表達水平可能是影響食管癌患者TNM分期的重要因素，其高表達促進了淋巴結(jié)的浸潤，從而進一步影響食管癌患者的預(yù)后。

Pim1在食管癌中受miRNA的多重調(diào)控[5-6]，而miRNA在食管以外的其他腫瘤中涉及多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控或信號通路的激活[7-9]，類似的機制同樣可能在食管癌中存在。Pim1基因影響食管癌發(fā)生及進展的機制十分復(fù)雜，可能成為食管癌治療的研究熱點。有研究顯示，Pim1高表達會降低腫瘤細胞對藥物治療的敏感性[10-11]，目前已有針對Pim1的靶向藥物正在研發(fā)當中[12]。提示Pim1抑制劑對腫瘤的治療具有十分重要的意義，Pim1可能成為食管癌治療的新靶點。

綜上所述，Pim1可能成為食管癌早期診斷及預(yù)后判斷的一個新的分子標志物，有待更大樣本量的研究進一步驗證。

[1] LIANG H，F(xiàn)AN J H，QIAOY L.Epidemiology，etiology and prevention of esophageal squamous cell carcinoma in China[J].CancerBiolMed，2017，14(1)：33-41.

[2] 于建，張景航，楊曉煜，等.真核細胞翻譯起始因子-4E 在食管癌變過程中的表達變化及意義[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2017，34(12)：1073-1075.

[3] 丁昭珩，丁罡.Pim-1基因表達與腫瘤相關(guān)性的研究進展[J].醫(yī)學綜述，2012，18(16)：2584-2586.

[4] LIU H T，WANG N，WANG X，etal.Overexpression of Pim-1 is associated with poor prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J].JSurgOncol，2010，102(6)：683-688.

[5] HAN Y，YANG X，ZHAO N，etal.Alpinumisoflavone induces apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma by modulating miR-370/Pim1 signaling[J].AmJCancerRes，2016，6(12)：2755-2771.

[6] SHARMA P，SARAYA A，GUPTA P，etal.Decreased levels of circulating and tissue miR-107 in human esophageal cancer[J].Biomarkers，2013，18(4)：322-330.

[7] NING T，ZHANG H，WANG X，etal.miR-370 regulates cell proliferation and migration by targeting EGFR in gastric cancer[J].OncolRep，2017，38(1)：384-392.

[8] YANG X，XIAO Z，DU X，etal.Silencing of the long non-coding RNA NEAT1 suppresses glioma stem-like properties through modulation of the miR-107/CDK6 pathway[J].OncolRep，2017，37(1)：555-562.

[9] ZHONG Z，LV M，CHEN J.Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma[J].SciRep，2016，6：30919.

[10] NATARAJAN K，BHULLAR J，SHUKLA S，etal.The Pim kinase inhibitor SGI-1776 decreases cell surface expression of P-glycoprotein (ABCB1) and breast cancer resistance protein (ABCG2) and drug transport by Pim-1-dependent and -independent mechanisms[J].BiochemPharmacol，2013，85(4)：514-524.

[11] MOODY S E，SCHINZEL A C，SINGH S，etal.PRKACA mediates resistance to HER2-targeted therapy in breast cancer cells and restores anti-apoptotic signaling[J].Oncogene，2015，34(16)：2061-2071.

[12] 鄭小洲，金曉磊，趙臨襄.小分子PIM激酶抑制劑的研究進展[J].中國藥物化學雜志，2013，23(6)：499-505.