王 皓，王少學(xué)，李素敏，韓東明

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.原陽縣人民醫(yī)院超聲科，河南 原陽 453500)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是常見的疾病，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[1]。AMI不僅給患者帶來極大的痛苦，同時也給家庭和社會帶來很大的負擔。因此，對心血管疾病的防治是刻不容緩的重大課題。研究表明，炎性因子參與了AMI的發(fā)展過程[2]。持續(xù)的炎癥反應(yīng)會誘導(dǎo)多個細胞死亡途徑激活，引起心肌細胞進行性凋亡，心肌組織損傷進一步加重，甚至導(dǎo)致心室重構(gòu)[3-4]。路妍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者外周血單個核細胞中Toll 樣受體(toll-like receptor，TLR)4表達顯著升高，且與冠狀動脈病變嚴重程度密切相關(guān)。另有研究證實，AMI患者尤其是合并不良心血管事件的患者血清中和不穩(wěn)定斑塊中TLR4、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)等促炎因子水平明顯升高，并且這種升高通常預(yù)示患者預(yù)后不良[6-7]。因此，推測阻斷或者抑制TLR信號途徑可減輕AMI后心肌損傷，并抑制心室重構(gòu)，對心臟起到保護作用，這也是目前心血管領(lǐng)域研究的熱點。黃芪甲甙是黃芪的主要活性成分。梁榮壽等[8]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可通過抑制TLR-4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路減輕脂多糖所致的炎癥反應(yīng)。李青等[9]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲甙可能通過抑制單核細胞TLR-4表達，抑制炎性因子產(chǎn)生，從而阻斷腎臟纖維化。另有研究報道，黃芪甲甙能減輕心肌梗死后心肌缺血[10]。但是，黃芪甲甙對心肌梗死后心肌的保護作用的具體機制尚不清楚，尤其黃芪甲甙對心臟的保護作用與TLR之間的關(guān)系還有待闡明。本研究通過結(jié)扎大鼠心臟左冠狀動脈前降支制備AMI模型，觀察黃芪甲甙對AMI大鼠心臟的保護作用，并對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康Wistar大鼠45只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半，均由河南省實驗動物中心提供[合格證號：SYXK(豫) 2011-001]。

1.2主要試劑與儀器黃芪甲甙(純度 > 98%)由中國藥品生物制品鑒定所提供，大鼠NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、大鼠心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)免疫試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司，一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒、TRIzol試劑、BeyoRT cDNA第1鏈合成試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，SYBR Green實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；ABI 7300 實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)、HX-100動物呼吸機購自成都泰盟科技有限公司，小動物超聲儀購自北京森西科技有限公司，AU 2700全自動生物化學(xué)分析儀購自日本奧林巴斯公司。

1.3動物分組及模型制備將45只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和黃芪甲甙組，每組15只。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。模型組和黃芪甲甙組大鼠采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法制備AMI模型[11]：大鼠用30 g·L-1水合氯醛(10 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，將大鼠四肢固定在自制泡沫手術(shù)板上；經(jīng)口氣管插管，接小動物呼吸機；四肢皮下插入針電極，使用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)描記肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖(electrocardiogram，ECG)；手術(shù)野脫毛膏脫毛，消毒，鋪無菌巾，沿左胸骨第3～4肋間開胸，放置開胸器(眼科開瞼器)，小心用鑷子在心臟收縮期提起心包膜并剪開，充分暴露心臟；于左心耳與肺動脈圓錐間以左冠狀靜脈為標志，左心耳根部下 2～3 mm 用5-0無創(chuàng)傷縫線穿過并結(jié)扎冠狀動脈左前降支；肉眼觀察前降支供血區(qū)變蒼白，收縮力降低，然后擠壓胸腔排出空氣并逐層關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎，其余操作同模型組。各組大鼠術(shù)后經(jīng)腹腔注射青霉素80萬U，連用3 d 以預(yù)防感染。

造模24 h后，黃芪甲甙組大鼠腹腔注射黃芪甲甙20 mg·kg-1·d-1(以10 g·L-1羧甲基纖維素鈉溶解)，假手術(shù)組、模型組大鼠腹腔注射相同體積的羧甲基纖維素鈉，每日1次，連續(xù)2周。

1.4心電圖監(jiān)測使用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)描記造模前、造模后即刻及給藥1、3、7、14 d肢體Ⅱ?qū)?lián)ECG，觀察ST段變化，并記錄ST段值。

1.5超聲心動圖檢測各組大鼠心功能給藥2 h后，各組大鼠用30 g·L-1水合氯醛(10 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，隨后仰臥位固定于恒溫加熱板上，脫毛膏脫毛后，用小動物超聲儀(頻率17.5 MHz)進行心臟超聲檢查[12]。分別檢測大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole，LVDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(the left ventricular internal diameter at end-systole，LVDS)、左心室舒張末期容積(left ventricular end diastolic volume，LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end systolic volume，LVESV)、左心室短軸的縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS) 和左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.6血清TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κB水平檢測末次給藥后4 h，大鼠麻醉，取各組大鼠下腔靜脈血4 mL，1 000×g離心25 min，取上清液，保存于-20 ℃待測。應(yīng)用ELISA法檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κB水平，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.7血漿NO水平檢測末次給藥后4 h，大鼠麻醉，取下腔靜脈血2 mL置于無菌抗凝管中，1 000×g離心25 min，取上清液。應(yīng)用NO檢測試劑盒，采用Griess反應(yīng)測定血漿亞硝酸鹽水平。按說明書要求依次加入待測樣品、Griess反應(yīng)試劑 I和II，每孔50 μL。在540 nm波長處記錄吸光度值，并使用亞硝酸鈉標準曲線對亞硝酸鹽進行定量，以血漿亞硝酸鹽含量來反映NO水平。

1.8實時熒光定量PCR檢測心肌組織中TLR2、TLR4、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotidebindingoligomerizationdomain，NOD)1、NOD2、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)mRNA表達末次給藥后4 h，大鼠取靜脈血后開胸，取左心室心肌組織。采用TRIzol試劑提取心肌組織總RNA。將1 μg心肌組織總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA第1鏈。然后使用SYBR Green 熒光定量PCR試劑盒，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA為模板，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，對基因進行熒光定量PCR擴增。TLR2上游引物為5′-TCTCCCATTTCCGTCTTTTT-3′，下游引物為5′-GGTCTTGGTGTTCATTATCTTC-3′；TLR4上游引物為5′-GAAGCTGGTGGCTGTGGA-3′，下游引物為5′-TGATGTAGAACCCGCAAG-3′；NOD1上游引物為5′-GTCACTGAGGTCCATCTGAAC-3′，下游引物為5′-CATCCACTCCTGGAAGAACCT-3′；NOD2上游引物為5′-CATGTGCTGCTACGTGTTCTC -3′，下游引物為5′-CCTGCCACAATTGAAGAGGTG-3′；eNOS上游引物為5′-TTCCGGCTGCCACCTGATCCTAA-3′，下游引物為5′-AACATGTGTCCTTGCTCGAGGCA-3′；GAPDH上游引物為5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物為5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，1個循環(huán)；95 ℃變性30 s，58 ℃ 退火45 s，70 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，各基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

2 結(jié)果

2.13組大鼠造模情況造模過程中，假手術(shù)組無大鼠死亡，模型組大鼠死亡4只，黃芪甲甙組大鼠死亡2只。

2.23組大鼠心電圖ST段值變化結(jié)果見表1。造模前各組大鼠ST段值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后即刻模型組和黃芪甲甙組大鼠心電圖ST段較假手術(shù)組顯著抬高(P<0.01)，表明AMI模型制作成功。模型組和黃芪甲甙組大鼠給藥1、3、7、14 d后ST段值均顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)。黃芪甲甙組大鼠給藥3、7、14 d后ST段值均顯著低于模型組(P<0.05)。

表13組大鼠心電圖ST段值的變化

注：與假手術(shù)組比較aP<0.01；與模型組比較bP<0.05，cP<0.01。

2.33組大鼠超聲心動圖各指標比較結(jié)果見表2。與假手術(shù)組比較，模型組和黃芪甲甙組大鼠LVDD、LVDS顯著擴大(P<0.01)、LVEDV、LVESV顯著增加(P<0.01)，LVFS、LVEF顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，黃芪甲甙組大鼠LVDD、LVDS顯著縮小(P<0.05)，LVEDV、LVESV顯著下降(P<0.05)，LVFS、LVEF顯著增加(P<0.05)。

表23組大鼠超聲心動圖指標比較

注：與假手術(shù)組比較aP<0.01，bP<0.05；與模型組比較cP<0.05，dP<0.01。

2.43組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB水平比較結(jié)果見表3。與假手術(shù)組比較，模型組和黃芪甲甙組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著增高(P<0.05)；模型組大鼠血清NF-κB水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，但黃芪甲甙組與假手術(shù)組大鼠NF-κB水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，黃芪甲甙組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB水平顯著降低(P<0.05)。

表33組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB水平比較

注：與假手術(shù)組比較aP<0.01，bP<0.05；與模型組比較cP<0.01，dP<0.05。

2.53組大鼠心肌組織中TLR2、TLR4、NOD1、NOD2mRNA表達比較結(jié)果見表4。與假手術(shù)組比較，模型組和黃芪甲甙組大鼠心肌組織中TLR2、TLR4、NOD1、NOD2 mRNA表達顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，黃芪甲甙組大鼠心肌組織中TLR2、TLR4、NOD1、NOD2 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。

表43組大鼠心肌組織中TLR2、TLR4、NOD1、NOD2mRNA表達比較

注：與假手術(shù)組比較aP<0.01，bP<0.05；與模型組比較cP<0.05，dP<0.01。

2.63組大鼠血漿NO水平和心肌組織中eNOSmRNA表達比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿NO水平和心肌組織中eNOS mRNA表達顯著降低 (P<0.05)。黃芪甲甙組大鼠血漿NO水平低于假手術(shù)組(P<0.05)，但2組大鼠心肌組織中eNOS mRNA表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，黃芪甲甙組大鼠血漿NO水平和心肌組織中eNOS mRNA表達顯著升高(P<0.01)。

表53組大鼠血漿NO水平和心肌組織中eNOSmRNA表達比較

Tab.5ComparisonofthelevelofNOinplasmaandtheexpressionofeNOSmRNAincardiacmuscletissueamongthethreegroups

(±s)

注：與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.01。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，黃芪甲甙組大鼠給藥3、7、14 d后ST段值均顯著下降，并且給藥14 d后，黃芪甲甙組大鼠LVDD、LVDS明顯縮小，LVEDV、LVESV明顯下降，LVFS、LVEF明顯增加；說明黃芪甲甙對AMI大鼠心肌損傷和心功能有明顯改善作用。TLRs在損傷引起的局部炎性反應(yīng)中起重要作用。TLR2和TLR4被認為是AMI時最常見和最具有特征性的炎性因子，它們通過激活細胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，釋放炎性介質(zhì)。TLR2參與AMI時炎性反應(yīng)的識別，并在免疫系統(tǒng)中起重要作用。TLR4是最早在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的Toll受體，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)中起著重要作用[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死時，TLR4基因和蛋白表達均增高[15]。NOD是一類含有核苷酸結(jié)合寡聚域的蛋白質(zhì)家族。TLR2和TLR4的肽多糖亞基可以被NOD家族蛋白識別，尤其是NOD1和NOD2。NOD1和NOD2是胞內(nèi)蛋白，參與先天性免疫，并與人類慢性炎性疾病密切相關(guān)。NOD信號途徑可活化NF-κB，還可以上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶家族，激活促炎性反應(yīng)基因[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌組織中TLR2、TLR4、NOD1和NOD2 mRNA表達均較假手術(shù)組顯著增加，黃芪甲甙組大鼠心肌組織中TLR2、TLR4、NOD1和NOD2 mRNA表達均較模型組顯著降低；說明黃芪甲甙可通過降低TLR2、TLR4、NOD1和NOD2 mRNA的表達發(fā)揮對心臟的保護作用。

TLR介導(dǎo)的信號通路可激活NF-κB，誘導(dǎo)下游分子如炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β等)、黏附分子和凋亡蛋白等靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達[18-20]。TNF-α、IL-1β 和 IL-6表達增高，可啟動和調(diào)節(jié)局部的急性應(yīng)激炎性反應(yīng)[21]，從而加重心肌的損傷[22]。臨床研究證實，心力衰竭患者循環(huán)系統(tǒng)組織和心肌組織中TNF-α、IL-1β 和 IL-6水平顯著升高，且其水平與患者疾病的嚴重程度密切相關(guān)[23]。TURNER等[24]研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化時，激活的NF-κB主要存在于平滑肌、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞，并參與心室重構(gòu)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的表達均較假手術(shù)組顯著升高，黃芪甲甙組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的表達較模型組顯著降低，這說明黃芪甲甙對AMI引起的心臟損傷有一定的保護作用。

另有研究表明，由 NOS經(jīng)還原型輔酶Ⅱ依賴性催化反應(yīng)催化底物L(fēng)-精氨酸產(chǎn)生的NO具有心臟保護作用，可對抗AMI。NOS共有3種亞基，包括神經(jīng)元NOS(nNOS或NOS1)、可誘導(dǎo)型NOS(iNOS或NOS2)和內(nèi)皮細胞NOS(eNOS或NOS3)。eNOS不僅在心內(nèi)膜和冠狀動脈內(nèi)皮表達，在心肌細胞和心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)如竇房結(jié)和房室組織中也存在[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，eNOS-/-小鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌損傷會加重，這說明由eNOS催化產(chǎn)生的NO具有心肌保護作用[26]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血漿中NO水平和心肌組織中eNOS mRNA表達顯著低于假手術(shù)組；黃芪甲甙組大鼠血漿中NO水平和心肌組織中eNOS mRNA表達顯著高于模型組。黃芪甲甙組大鼠血漿NO水平低于假手術(shù)組，但2組大鼠心肌組織中eNOS mRNA表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；這說明黃芪甲甙能通過激活eNOS、增加NO的生成而發(fā)揮對AMI大鼠心臟的保護作用。

總之，本研究證實黃芪甲甙對AMI大鼠具有心臟保護作用，其心臟保護作用的發(fā)揮可能與激活eNOS信號系統(tǒng)和抑制炎性因子生成有關(guān)。黃芪甲甙是有前景的心臟保護藥物，可用于預(yù)防和治療AMI所致的心臟損傷。同時eNOS信號通路和TLR信號途徑將來也可能成為缺血性心臟病的潛在治療靶點。

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