李向陽 華 慧 顏 超 于 倩 鄭葵陽 湯仁仙

(徐州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，徐州 221004)

流式細(xì)胞儀技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)，是應(yīng)用流式細(xì)胞儀，結(jié)合單克隆抗體技術(shù)、免疫熒光染色技術(shù)，對快速流動液體中的單細(xì)胞進(jìn)行多種參數(shù)測量和分析，檢測速度快、精確性高，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域[1]。流式微球捕獲芯片技術(shù)(cytometrin bead array,CBA)微量樣本多重蛋白定量技術(shù)，是用流式細(xì)胞儀對多重蛋白進(jìn)行定量檢測的方法，能夠同時對樣本中的多個指標(biāo)進(jìn)行定性、定量檢測。血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清、積液中的細(xì)胞因子，由于這些細(xì)胞因子含量低，不容易檢測，加上樣本數(shù)量少，傳統(tǒng)的方法無法滿足多因子檢測[2]。

CBA檢測系統(tǒng)采用聚苯乙烯熒光微球連結(jié)特定的捕獲抗體，捕捉待測物，同時再加入待測物的熒光抗體，三者形成夾心復(fù)合物，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測[3-4]。小鼠血清Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子是實驗中經(jīng)常會用到的檢測指標(biāo)，由于血清量少很難運用傳統(tǒng)的方法如ELISA法進(jìn)行多因子檢測，而CBA法正好能解決這一問題，它能夠一次性對血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Υ、TNF、IL-10、IL-17A進(jìn)行定量檢測。但是由于CBA操作過程繁瑣，從樣本處理、上機(jī)檢測到數(shù)據(jù)處理都對實驗者要求較高，每一步操作出現(xiàn)失誤都會影響到結(jié)果。故此本文結(jié)合之前的實驗案例，將實驗操作中常出現(xiàn)的問題及解決方法進(jìn)行分析和總結(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

BD Cytometric Bead Array(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit( Catalog No.560485)；BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀；華支睪吸蟲感染小鼠血清；FCAP分析軟件；流式上樣管；15ml離心管。

1.2 方法

1.2.1檢測樣本制備主要步驟 制備小鼠Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品；混合人Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子捕獲微球；標(biāo)準(zhǔn)品管及樣本管分別加入微球及相應(yīng)的樣本，加Th1/Th2/Th17 PE檢測試劑，2h后洗滌，上機(jī)檢測。

1.2.2流式細(xì)胞儀調(diào)整 從BD官網(wǎng)下載CBA儀器調(diào)整模板，將模板通過Diva軟件導(dǎo)入到機(jī)器中。打開模板，運用Cytometer Setup Beads(CBA試劑盒配備)調(diào)整機(jī)器參數(shù)包括調(diào)整P1細(xì)胞群，調(diào)節(jié)FITC、PE、APC電壓等，參照說明書進(jìn)行，在此不再贅述。

1.2.3FCAP軟件分析 從Diva軟件中導(dǎo)出數(shù)據(jù)，其格式為FCS2.0文件。打開FCAP軟件，導(dǎo)入相應(yīng)的FCS2.0文件進(jìn)行分析，包括制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本濃度等。

2 標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)檢測流式圖

正常的CBA標(biāo)準(zhǔn)品檢測流式圖，表現(xiàn)為在FSC-A /SSC-A圖上顯示一群微球位于門P1之內(nèi)，見圖1A；在PE-A/APC-A散點圖表現(xiàn)為7群，從上到下依次為IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Υ、TNF、IL-10、IL-17A，群之間清晰無連接，無聚集成團(tuán)，無多群現(xiàn)象，見圖1B；APC-A通道上也顯示為清晰的7群，見圖1C。

圖1 正常CBA流式檢測圖

3 常見問題分析及解決方法

3.1 微球聚集成團(tuán)，分群不清晰

在檢測小鼠血清樣本的時候，正常流式散點圖上顯示為7群，見圖2A；但是有時會顯示多群，甚至聚集成團(tuán)，見圖2B。微球由聚苯乙烯材料制作而成，血清加入微球之后如果沒有充分渦旋，容易沉淀聚集，細(xì)胞因子不能充分跟微球結(jié)合，導(dǎo)致多群甚至聚集現(xiàn)象發(fā)生，檢測結(jié)果將是無效的。從制備混合微球開始到加入實驗管，直到上機(jī)檢測前每一步都必須充分渦旋，以避免微球發(fā)生聚集。

圖2 微球聚集現(xiàn)象

3.2 散點圖上顯示8群或者多群

CBA實驗上機(jī)檢測后需要用到FACP軟件進(jìn)行分析，但是此軟件嚴(yán)格要求在APC通道上顯示為7群，多群，少群將無法檢測。在檢測血清時候，由于血清成分比較復(fù)雜，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等；同時在小鼠取血過程中都會有部分溶血，血細(xì)胞中的成分如紅細(xì)胞碎片，血紅蛋白等釋放到血清中；這些物質(zhì)會影響到微球與細(xì)胞因子的結(jié)合，影響到整個體系中的組分，所以經(jīng)常會出現(xiàn)多群現(xiàn)象，這樣的檢測結(jié)果將無法分析，見圖3。如何處理這樣的數(shù)據(jù)直接影響到實驗結(jié)果。

圖3 APC通道顯示多群微球

我們在PE-A/APC-A散點圖上重新設(shè)一個門P2，見圖4A；其邏輯關(guān)系如圖4C所示，與模板自帶的門P1并行同屬于“All Events”。門P2將所需要的目的微球群圈選在內(nèi)，非目的微球群排除在外，此時在APC-A通道上可清晰顯示出7個微球群，如圖4B所示。門設(shè)置完成后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出時，一定要選擇導(dǎo)出目標(biāo)數(shù)據(jù)為 “P2”，這樣我們檢測的數(shù)據(jù)就夠在FACP軟件進(jìn)行分析，7種細(xì)胞因子的數(shù)值也能依次計算出來。

圖4 設(shè)門選中目標(biāo)微球群

3.3 FSC/SSC的檢測圖中碎片過多

在檢測血清樣本時FSC/SSC的檢測圖中經(jīng)常會出現(xiàn)碎片過多，見圖5；影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性，此時應(yīng)調(diào)整機(jī)器的狀態(tài)，上調(diào)FSC/SSC的閾值，如果問題仍然存在，重復(fù)樣本洗滌步驟，或者稀釋血清，盡量減少血清中的雜質(zhì)成分如紅細(xì)胞碎片。

圖5 FSC/SSC的檢測圖出現(xiàn)大量碎片

3.4 檢測樣本濃度低于標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度

當(dāng)樣本中待測細(xì)胞因子濃度很低的時候經(jīng)常會出現(xiàn)樣本值位于標(biāo)準(zhǔn)曲線之外，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確或者無結(jié)果，此時我們在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時候，增加額外的稀釋濃度點如10、5、2.5、1.25pg/ml。此時樣本值就能被檢測出來，并且結(jié)果是可信的。

4 討論

流式細(xì)胞儀以其檢測速度快、檢測手段靈活、多指標(biāo)、多參數(shù)、靈敏度(可達(dá)0.3pg/ml)等特點已成為基礎(chǔ)科研，臨床檢測等必不可少的技術(shù)手段[5-6]。CBA是流式細(xì)胞術(shù)的一個新技術(shù)，整合了免疫微球、激光檢測、信號處理及計算機(jī)運算等功能。CBA將近似于細(xì)胞大小的微珠作為捕獲載體，使其攜帶已知熒光抗原或抗體，來捕獲檢測物中的相關(guān)抗體或抗原。由于遮蔽效應(yīng)可以使熒光微球的發(fā)散光減弱，應(yīng)用不同大小的熒光微球，可同時檢測同一標(biāo)本的多種抗原或抗體。這種方法能同時檢測單一液相樣本中多個目的蛋白(如同時測定多種細(xì)胞因子、多種自身抗體等)，檢測需用標(biāo)本量少，靈敏度高，重復(fù)性好，直接熒光標(biāo)記易于使用，檢測線性范圍寬，避免酶聯(lián)反應(yīng)所致的人工假象，可用于單細(xì)胞分子水平的多參數(shù)檢驗，也可用于真菌、寄生蟲、病毒或混合感染的檢測。較傳統(tǒng)的ELISA有較大的優(yōu)勢，CBA檢測所需樣本體積為傳統(tǒng)ELISA的1/6，對于稀有樣本，CBA是目前最好的選擇，少量樣本即可檢測細(xì)胞因子、抗體、抗原等多個指標(biāo)；同時CBA穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高，能避免酶聯(lián)免疫放大技術(shù)使信號失真導(dǎo)致的假陽性[7-8]。

CBA法能夠?qū)颖景ㄑ?、?xì)胞培養(yǎng)上清、滲出液等可溶性細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測，此方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)領(lǐng)域、干細(xì)胞領(lǐng)域、腫瘤研究及疾病的治療等。CBA檢測速度快，靈敏度高，樣本使用量少，50μl體積即可對多種細(xì)胞因子進(jìn)行快速定量檢測，但是由于操作過程繁瑣，對實驗人員技術(shù)要求高，從一定程度上限制了其廣泛使用[9-10]。在檢測血清時，由于血清成分復(fù)雜，細(xì)胞因子含量差距大，實驗中經(jīng)常會出現(xiàn)分群不明顯，微球聚集，濃度太低等現(xiàn)象，對實驗結(jié)果造成很大影響；CBA試劑盒說明書上雖然有相關(guān)步驟及問題處理方法，但是過于籠統(tǒng)，沒有具體的案例，操作人員往往要經(jīng)過多次摸索才能夠做出較為滿意的結(jié)果，本文主要結(jié)合實驗過程中常見到的問題，對其進(jìn)行分析，并找出解決問題的方法，為實驗人員提供參考，避免實驗中一些技術(shù)問題的出現(xiàn)，及遇到相似的問題能夠盡快得到解決，從而提高實驗的有效性和準(zhǔn)確性。

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