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        響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲輔助提取諸葛菜總黃酮工藝及抗氧化活性研究

        2018-03-27 01:33:02賽春梅崔琳琳周明哲金信表王建安
        關(guān)鍵詞:黃酮

        賽春梅 崔琳琳 楊 夢(mèng) 周明哲 金信表 王建安

        (濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院, 日照 276826)

        諸葛菜(OrychophragmusviolaceusL.Schulz)別名二月蘭,系十字花科諸葛菜屬植物,是一種分布廣泛,生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)的野生植物[1-2]。諸葛菜嫩葉和莖可食用,含胡蘿卜素等多種營(yíng)養(yǎng)成分,全草入藥具有開胃下氣、利濕解毒的功效[3],現(xiàn)代藥理研究表明,諸葛菜還有抑菌、抗腫瘤、促進(jìn)消化、降低膽固醇等作用??傸S酮是其重要的生理活性物質(zhì),具有抗炎、抗輻射、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用。

        超聲輔助技術(shù)在中藥提取中具有提取效率高,提取時(shí)間短,提取條件溫和,綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)[4-5]。本文采用超聲輔助提取諸葛菜中總黃酮,通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Box-Behnken design,BBD)[6-7],設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)曲面分析方法優(yōu)選超聲提取工藝參數(shù),并研究其抗氧化活性,為諸葛菜進(jìn)一步的開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。響應(yīng)曲面法通過建立連續(xù)變量的模型,對(duì)各影響因素及交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià),同時(shí)用曲面圖和等高線圖表示出來,比正交設(shè)計(jì)更直觀、精確。該方法現(xiàn)已廣泛用于中藥提取、食品工業(yè)等領(lǐng)域的工藝優(yōu)化。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        102-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(龍口市先科儀器公司);JJ224BC電子天平(美國(guó)G&G公司);JDH-2G微波干燥殺菌箱(廣州永澤微波能設(shè)備有限公司);CS-700高速多功能粉碎機(jī)(永康市天棋盛世工貿(mào)有限公司);KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

        1.2 材料

        諸葛菜(本品于2017年4月、5月、6月采集于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院日照校區(qū)本草園,經(jīng)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院王建安副教授鑒定為十字花科諸葛菜屬植物諸葛菜OrychophragmusviolaceusL.Schulz,干燥,粉碎,過60目篩,置干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?;蘆丁對(duì)照品(批號(hào):20150701)購于中國(guó)食品藥品檢定研究院;D4313 DPPH(批號(hào):AYSJB-IQ)購于東京化成工業(yè)株式會(huì)所;AR抗壞血酸(批號(hào):20120910)購于江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司;亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、乙酸鈉、結(jié)晶乙酸鈉、三氯化鋁、乙酸試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 諸葛菜總黃酮的測(cè)定

        2.1.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱定蘆丁對(duì)照品20.00mg于100ml 容量瓶中,加入60%乙醇溶解,定容至刻度,搖勻,即得濃度為0.20mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

        2.1.2供試品溶液的制備 將采集于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院日照校區(qū)本草園花蕾期的諸葛菜,低溫干燥,粉碎,過60目篩,精密稱取0.5000g置于50ml具塞錐形瓶中,加入60%乙醇20ml,超聲提取30min,抽濾,即得供試品溶液。

        2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和線性范圍 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml于25ml容量瓶中,用60%乙醇補(bǔ)充至5.0ml,加入0.1mol/L AlCl3溶液4.0ml,pH 5.4 NaAc-HAc緩沖溶液4.0ml,40 ℃水浴顯色20min,室溫放置10min后用60%乙醇定容至刻度,采用紫外可見分光光度計(jì)于410nm處測(cè)其吸光度,以蘆丁對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性回歸方程為y=26.786x+0.0199 (R2=0.9992),結(jié)果表明蘆丁在4~28 g /ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.1.4精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液,按2.1.3項(xiàng)下的方法,連續(xù)測(cè)定6次,計(jì)算總黃酮吸光度的RSD為0.61%(n=6),表明精密度良好。

        2.1.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,按2.1.3項(xiàng)下的方法,分別在0、10、20、30、60、90、120min時(shí)各測(cè)定1次,計(jì)算總黃酮吸光度的RSD為1.07%(n=6),結(jié)果表明供試品溶液在120min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.1.6重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定諸葛菜粉末6份,每份0.5000g于50ml具塞錐形瓶中,分別加入20ml 60%乙醇,超聲提取30min,抽濾,記錄濾液體積,精密吸取上述樣品溶液1.0ml置25ml容量瓶中,用60%乙醇補(bǔ)足至5.0ml,按2.1.3下的顯色方法顯色,在410nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算總黃酮平均含量為14.15mg/g,RSD為1.03%(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。

        2.1.7加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的諸葛菜粉末6份,每份0.2500g,分別精密加入一定量的蘆丁對(duì)照品,依法制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得蘆丁的平均回收率為102.22%,RSD為1.63%,表明該方法準(zhǔn)確性良好。

        2.2 超聲提取諸葛菜總黃酮工藝研究

        2.2.1單因素試驗(yàn) 1)超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 采用乙醇濃度60%,料液比1∶40,超聲時(shí)間30min,超聲提取諸葛菜總黃酮,考察不同超聲溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)對(duì)總黃酮提取率的影響。見圖1。

        圖1 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

        圖1表明,隨超聲溫度的增加,總黃酮提取率逐漸提高,當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃,總黃酮提取率達(dá)到最大,之后總黃酮提取率隨溫度升高而降低,因此最佳超聲溫度選擇40 ℃。

        2)料液比對(duì)總黃酮提取率的影響:采用乙醇濃度60%,超聲溫度40 ℃,超聲時(shí)間30min條件提取諸葛菜總黃酮,考察不同料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70對(duì)總黃酮提取率的影響。見圖2。

        圖2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

        由圖2可知,諸葛菜總黃酮提取率隨料液比的增加而升高,當(dāng)料液比為1∶50時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最高,其后隨料液比升高提取率下降,因此最佳料液比選取1∶50。

        3)超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響:采用料液比1∶50,乙醇濃度60%,超聲溫度40 ℃ 條件超聲提取總黃酮,考察不同超聲時(shí)間30、40、50、60、70min對(duì)諸葛菜總黃酮提取率的影響。見圖3。

        圖3表明,隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng),諸葛菜總黃酮提取率逐漸增大,總黃酮提取率在50min時(shí)達(dá)到最大,其后隨時(shí)間的增加總黃酮提取率逐漸降低,因此50min為最佳提取時(shí)間。

        圖3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

        4)乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響:采用料液比1∶50,超聲溫度40 ℃,超聲時(shí)間50min條件提取總黃酮,研究乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%、90%對(duì)總黃酮提取率的影響。見圖4。

        圖4 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

        圖4表明,隨著乙醇濃度的增大,諸葛菜中總黃酮提取率逐漸升高,當(dāng)乙醇濃度達(dá)70%時(shí),總黃酮提取率達(dá)到最高,其后隨乙醇濃度的增大,總黃酮提取率降低,因此最佳乙醇濃度為70%。

        2.2.2響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Design Expert 8.0.6軟件,依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)、超聲溫度(D)影響總黃酮提取率的四個(gè)主要因素,以諸葛菜總黃酮含量為響應(yīng)值,進(jìn)行試驗(yàn)分析。試驗(yàn)因素水平編碼設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表1、2、3。

        表1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)因素與水平表

        表2 響應(yīng)曲面中心組合方案與響應(yīng)值

        表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果

        如表3方差分析所示,乙醇濃度(P<0.001)、超聲溫度(P<0.001)對(duì)諸葛菜總黃酮提取率有極顯著性影響,料液比(P<0.05)對(duì)諸葛菜總黃酮提取率有顯著性影響,而超聲時(shí)間影響不顯著,AC、A2、B2、C2、D2是顯著型模型。

        以總黃酮含量為響應(yīng)值,經(jīng)回歸擬合后,得到回歸方程:總黃酮含量=21.51+0.56A+0.28B-1.60C-1.90D-0.12AB+1.03AC+0.3AD-0.65BC-0.73BD-0.37CD-3.10A2-3.40B2-3.69C2-4.90D2,根據(jù)方差結(jié)果顯示,F(xiàn)回歸=47.63,P<0.0001,表明二次多元回歸方程與響應(yīng)值之間的關(guān)系模型顯著,差擬項(xiàng)檢驗(yàn)值P=0.4642>0.05(不顯著),R2=0.9031,說明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù),可用此回歸方程確定諸葛菜總黃酮的最佳提取工藝。

        2.2.3效應(yīng)面分析 通過多元回歸方程繪制效應(yīng)曲面圖,可以直觀的反應(yīng)各因素及兩兩因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響,效應(yīng)曲面圖見圖5。

        圖5 料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)與超聲溫度(D)兩兩交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的效應(yīng)曲面圖

        如圖5所示,三維空間曲面直觀反映了各變量交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響,隨著A、B、C、D值的增大,總黃酮提取率逐漸提高,當(dāng)達(dá)到最大值后,隨著各變量值的繼續(xù)增大,總黃酮提取率有所下降。通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析,諸葛菜總黃酮最佳提取工藝條件為料液比1∶50,超聲時(shí)間50.80min,乙醇濃度67.92%,超聲溫度38.09℃,此條件下總黃酮提取率為21.88mg/g,考慮到實(shí)際操作需要,將實(shí)驗(yàn)條件修訂為料液比1∶50,超聲時(shí)間51min,乙醇濃度70%,超聲溫度39℃。在此最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),諸葛菜總黃酮平均提取率為21.83mg/g,與理論預(yù)測(cè)值21.88基本吻合,偏差很小,說明該模型可靠,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的超聲提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確,具有可行性。

        2.3 諸葛菜總黃酮含量及抗氧化活性結(jié)果比較

        2.3.1體外抗氧化活性測(cè)定 精密稱取DPPH 8.0mg于100ml棕色容量瓶中,用無水乙醇溶解并定容到刻度,配成濃度為2.0×10-4mol/L DPPH溶液,將樣品溶液配成濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.15mg/ml,分別加入DPPH溶液或無水乙醇后避光反應(yīng)60min后于510nm處測(cè)定吸光度。按照以下公式計(jì)算諸葛菜總黃酮對(duì)DPPH·清除率[8-10]。用相同濃度Vc做陽性對(duì)照。

        DPPH·清除率%=[1-(A1-A2)/A0]×100%

        A1:樣品溶液+DPPH溶液,A2:樣品溶液+無水乙醇,A0:無水乙醇+DPPH溶液

        2.3.2不同生長(zhǎng)時(shí)期諸葛菜總黃酮含量及抗氧化活性比較 將諸葛菜花蕾期、初花期、大花期及結(jié)果期的新鮮藥材置于陰涼通風(fēng)處干燥,粉碎,過60目篩,分別精密稱定上述干燥藥材粉末3份,每份0.5000g于50ml具塞錐形瓶中,加入70%乙醇25ml,在38℃下超聲提取51min,抽濾,取濾液,顯色后測(cè)定吸光度,計(jì)算總黃酮含量,按2.3.1測(cè)定體外抗氧化活性。見圖6,7。

        圖6 不同生長(zhǎng)期諸葛菜總黃酮含量比較

        圖7 不同生長(zhǎng)期諸葛菜抗氧化活性比較

        由圖6可知,不同生長(zhǎng)期諸葛菜總黃酮含量:花蕾期>初花期>大花期>結(jié)果期,由圖7所示,不同生長(zhǎng)期諸葛菜總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力均隨著樣品溶液濃度增大而增加,在10~50μg/ml增長(zhǎng)幅度較大,超過50μg/ml時(shí),逐漸趨于平緩。由此可知,花蕾期總黃酮含量及抗氧化活性最高。

        2.3.3不同藥用部位諸葛菜總黃酮含量及抗氧化活性比較 將大花期諸葛菜新鮮藥材根、莖、葉、花、果實(shí)分離,分別置微波干燥殺菌箱中45℃下微波干燥,將干燥后藥材分別粉碎,過60目篩,按2.3.1方法測(cè)定總黃酮含量及體外抗氧化活性。結(jié)果見圖8,9。

        圖8 不同藥用部位諸葛菜總黃酮含量比較

        圖9 不同藥用部位諸葛菜抗氧化活性比較

        由圖8可知,不同藥用部位諸葛菜總黃酮含量:葉>花>莖>根>果實(shí),由圖9可知,不同藥用部位諸葛菜總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力均隨著樣品溶液濃度增大而增加,在10~50μg/ml增長(zhǎng)幅度較大,超過50μg/ml時(shí),逐漸趨于平緩。由此可知,葉的總黃酮含量及抗氧化活性最高。

        2.3.4不同干燥方法諸葛菜總黃酮含量及抗氧化活性比較 將置于不同干燥方法下干燥后的大花期諸葛菜藥材粉碎,過60目篩,按2.3.1方法測(cè)定總黃酮含量及體外抗氧化活性。結(jié)果見圖10,11。

        圖10 不同干燥方法諸葛菜總黃酮含量比較

        圖11 不同干燥方法諸葛菜抗氧化活性比較

        由圖10可知,不同干燥方法諸葛菜總黃酮含量:低溫鼓風(fēng)干燥>微波干燥>陰干,由圖11所示,不同干燥方法諸葛菜總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力在10~50μg/ml范圍內(nèi)呈較好的量效關(guān)系。陰干法清除能力可達(dá)84.96%,微波干燥法為83.58%,低溫鼓風(fēng)干燥為81.76%。雖然陰干法抗氧化活性最高,但總黃酮含量相對(duì)較低;低溫干燥法和微波干燥法抗氧化活性差異較小,其中,陰干法總黃酮含量相對(duì)較高,因微波干燥法所需時(shí)間較短,因此選擇微波法作為諸葛菜最佳干燥方法。

        3 討論

        本課題在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化諸葛菜總黃酮超聲提取工藝,試驗(yàn)結(jié)果表明:在料液比1∶50、超聲時(shí)間51min、超聲溫度38℃、乙醇濃度68%條件下,諸葛菜中總黃酮含量為21.83mg/g,與模型預(yù)測(cè)值基本相近,從而說明該方法可行。通過對(duì)比不同干燥方法,不同藥用部位和不同生長(zhǎng)期諸葛菜總黃酮含量和抗氧化活性,選擇微波法干燥,葉和花蕾期總黃酮含量和抗氧化活性相對(duì)較高。本文通過對(duì)諸葛菜總黃酮提取工藝及抗氧化活性的研究,為諸葛菜有效成分的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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