賽春梅 崔琳琳 楊 夢(mèng) 周明哲 金信表 王建安

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 日照 276826)

諸葛菜(OrychophragmusviolaceusL.Schulz)別名二月蘭，系十字花科諸葛菜屬植物，是一種分布廣泛，生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)的野生植物[1-2]。諸葛菜嫩葉和莖可食用，含胡蘿卜素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，全草入藥具有開胃下氣、利濕解毒的功效[3]，現(xiàn)代藥理研究表明，諸葛菜還有抑菌、抗腫瘤、促進(jìn)消化、降低膽固醇等作用?？傸S酮是其重要的生理活性物質(zhì)，具有抗炎、抗輻射、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用。

超聲輔助技術(shù)在中藥提取中具有提取效率高，提取時(shí)間短，提取條件溫和，綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)[4-5]。本文采用超聲輔助提取諸葛菜中總黃酮，通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Box-Behnken design，BBD)[6-7]，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)曲面分析方法優(yōu)選超聲提取工藝參數(shù)，并研究其抗氧化活性，為諸葛菜進(jìn)一步的開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。響應(yīng)曲面法通過建立連續(xù)變量的模型，對(duì)各影響因素及交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，同時(shí)用曲面圖和等高線圖表示出來，比正交設(shè)計(jì)更直觀、精確。該方法現(xiàn)已廣泛用于中藥提取、食品工業(yè)等領(lǐng)域的工藝優(yōu)化。

1 儀器與材料

1.1 儀器

102-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(龍口市先科儀器公司)；JJ224BC電子天平(美國(guó)G&G公司)；JDH-2G微波干燥殺菌箱(廣州永澤微波能設(shè)備有限公司)；CS-700高速多功能粉碎機(jī)(永康市天棋盛世工貿(mào)有限公司)；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 材料

諸葛菜(本品于2017年4月、5月、6月采集于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院日照校區(qū)本草園，經(jīng)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院王建安副教授鑒定為十字花科諸葛菜屬植物諸葛菜OrychophragmusviolaceusL.Schulz，干燥，粉碎，過60目篩，置干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?；蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：20150701)購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；D4313 DPPH(批號(hào)：AYSJB-IQ)購于東京化成工業(yè)株式會(huì)所；AR抗壞血酸(批號(hào)：20120910)購于江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、乙酸鈉、結(jié)晶乙酸鈉、三氯化鋁、乙酸試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 諸葛菜總黃酮的測(cè)定

2.1.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱定蘆丁對(duì)照品20.00mg于100ml 容量瓶中，加入60%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.20mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 將采集于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院日照校區(qū)本草園花蕾期的諸葛菜，低溫干燥，粉碎，過60目篩，精密稱取0.5000g置于50ml具塞錐形瓶中，加入60%乙醇20ml，超聲提取30min，抽濾，即得供試品溶液。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和線性范圍 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml于25ml容量瓶中，用60%乙醇補(bǔ)充至5.0ml，加入0.1mol/L AlCl3溶液4.0ml，pH 5.4 NaAc-HAc緩沖溶液4.0ml，40 ℃水浴顯色20min，室溫放置10min后用60%乙醇定容至刻度，采用紫外可見分光光度計(jì)于410nm處測(cè)其吸光度，以蘆丁對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性回歸方程為y=26.786x+0.0199 (R2=0.9992)，結(jié)果表明蘆丁在4～28 g /ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下的方法，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算總黃酮吸光度的RSD為0.61%(n=6)，表明精密度良好。

2.1.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下的方法，分別在0、10、20、30、60、90、120min時(shí)各測(cè)定1次，計(jì)算總黃酮吸光度的RSD為1.07%(n=6)，結(jié)果表明供試品溶液在120min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定諸葛菜粉末6份，每份0.5000g于50ml具塞錐形瓶中，分別加入20ml 60%乙醇，超聲提取30min，抽濾，記錄濾液體積，精密吸取上述樣品溶液1.0ml置25ml容量瓶中，用60%乙醇補(bǔ)足至5.0ml，按2.1.3下的顯色方法顯色，在410nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮平均含量為14.15mg/g，RSD為1.03%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的諸葛菜粉末6份，每份0.2500g，分別精密加入一定量的蘆丁對(duì)照品，依法制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得蘆丁的平均回收率為102.22%，RSD為1.63%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.2 超聲提取諸葛菜總黃酮工藝研究

2.2.1單因素試驗(yàn) 1)超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 采用乙醇濃度60%，料液比1∶40，超聲時(shí)間30min，超聲提取諸葛菜總黃酮，考察不同超聲溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)對(duì)總黃酮提取率的影響。見圖1。

圖1 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

圖1表明，隨超聲溫度的增加，總黃酮提取率逐漸提高，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃，總黃酮提取率達(dá)到最大，之后總黃酮提取率隨溫度升高而降低，因此最佳超聲溫度選擇40 ℃。

2)料液比對(duì)總黃酮提取率的影響：采用乙醇濃度60%，超聲溫度40 ℃，超聲時(shí)間30min條件提取諸葛菜總黃酮，考察不同料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70對(duì)總黃酮提取率的影響。見圖2。

圖2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2可知，諸葛菜總黃酮提取率隨料液比的增加而升高，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最高，其后隨料液比升高提取率下降，因此最佳料液比選取1∶50。

3)超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響：采用料液比1∶50，乙醇濃度60%，超聲溫度40 ℃ 條件超聲提取總黃酮，考察不同超聲時(shí)間30、40、50、60、70min對(duì)諸葛菜總黃酮提取率的影響。見圖3。

圖3表明，隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，諸葛菜總黃酮提取率逐漸增大，總黃酮提取率在50min時(shí)達(dá)到最大，其后隨時(shí)間的增加總黃酮提取率逐漸降低，因此50min為最佳提取時(shí)間。

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

4)乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響：采用料液比1∶50，超聲溫度40 ℃，超聲時(shí)間50min條件提取總黃酮，研究乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%、90%對(duì)總黃酮提取率的影響。見圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

圖4表明，隨著乙醇濃度的增大，諸葛菜中總黃酮提取率逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)70%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高，其后隨乙醇濃度的增大，總黃酮提取率降低，因此最佳乙醇濃度為70%。

2.2.2響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6軟件，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)、超聲溫度(D)影響總黃酮提取率的四個(gè)主要因素，以諸葛菜總黃酮含量為響應(yīng)值，進(jìn)行試驗(yàn)分析。試驗(yàn)因素水平編碼設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表1、2、3。

表1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)因素與水平表

表2 響應(yīng)曲面中心組合方案與響應(yīng)值

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果

如表3方差分析所示，乙醇濃度(P<0.001)、超聲溫度(P<0.001)對(duì)諸葛菜總黃酮提取率有極顯著性影響，料液比(P<0.05)對(duì)諸葛菜總黃酮提取率有顯著性影響，而超聲時(shí)間影響不顯著，AC、A2、B2、C2、D2是顯著型模型。

以總黃酮含量為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：總黃酮含量=21.51+0.56A+0.28B-1.60C-1.90D-0.12AB+1.03AC+0.3AD-0.65BC-0.73BD-0.37CD-3.10A2-3.40B2-3.69C2-4.90D2，根據(jù)方差結(jié)果顯示，F(xiàn)回歸=47.63，P<0.0001，表明二次多元回歸方程與響應(yīng)值之間的關(guān)系模型顯著，差擬項(xiàng)檢驗(yàn)值P=0.4642>0.05(不顯著)，R2=0.9031，說明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，可用此回歸方程確定諸葛菜總黃酮的最佳提取工藝。

2.2.3效應(yīng)面分析 通過多元回歸方程繪制效應(yīng)曲面圖，可以直觀的反應(yīng)各因素及兩兩因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，效應(yīng)曲面圖見圖5。

圖5 料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)與超聲溫度(D)兩兩交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的效應(yīng)曲面圖

如圖5所示，三維空間曲面直觀反映了各變量交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響，隨著A、B、C、D值的增大，總黃酮提取率逐漸提高，當(dāng)達(dá)到最大值后，隨著各變量值的繼續(xù)增大，總黃酮提取率有所下降。通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析，諸葛菜總黃酮最佳提取工藝條件為料液比1∶50，超聲時(shí)間50.80min，乙醇濃度67.92%，超聲溫度38.09℃，此條件下總黃酮提取率為21.88mg/g，考慮到實(shí)際操作需要，將實(shí)驗(yàn)條件修訂為料液比1∶50，超聲時(shí)間51min，乙醇濃度70%，超聲溫度39℃。在此最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，諸葛菜總黃酮平均提取率為21.83mg/g，與理論預(yù)測(cè)值21.88基本吻合，偏差很小，說明該模型可靠，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的超聲提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確，具有可行性。

2.3 諸葛菜總黃酮含量及抗氧化活性結(jié)果比較

2.3.1體外抗氧化活性測(cè)定 精密稱取DPPH 8.0mg于100ml棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容到刻度，配成濃度為2.0×10-4mol/L DPPH溶液，將樣品溶液配成濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.15mg/ml，分別加入DPPH溶液或無水乙醇后避光反應(yīng)60min后于510nm處測(cè)定吸光度。按照以下公式計(jì)算諸葛菜總黃酮對(duì)DPPH·清除率[8-10]。用相同濃度Vc做陽性對(duì)照。

DPPH·清除率%=[1-(A1-A2)/A0]×100%

A1：樣品溶液+DPPH溶液，A2：樣品溶液+無水乙醇，A0：無水乙醇+DPPH溶液

2.3.2不同生長(zhǎng)時(shí)期諸葛菜總黃酮含量及抗氧化活性比較 將諸葛菜花蕾期、初花期、大花期及結(jié)果期的新鮮藥材置于陰涼通風(fēng)處干燥，粉碎，過60目篩，分別精密稱定上述干燥藥材粉末3份，每份0.5000g于50ml具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25ml，在38℃下超聲提取51min，抽濾，取濾液，顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，按2.3.1測(cè)定體外抗氧化活性。見圖6，7。

圖6 不同生長(zhǎng)期諸葛菜總黃酮含量比較

圖7 不同生長(zhǎng)期諸葛菜抗氧化活性比較

由圖6可知，不同生長(zhǎng)期諸葛菜總黃酮含量：花蕾期>初花期>大花期>結(jié)果期，由圖7所示，不同生長(zhǎng)期諸葛菜總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力均隨著樣品溶液濃度增大而增加，在10～50μg/ml增長(zhǎng)幅度較大，超過50μg/ml時(shí)，逐漸趨于平緩。由此可知，花蕾期總黃酮含量及抗氧化活性最高。

2.3.3不同藥用部位諸葛菜總黃酮含量及抗氧化活性比較 將大花期諸葛菜新鮮藥材根、莖、葉、花、果實(shí)分離，分別置微波干燥殺菌箱中45℃下微波干燥，將干燥后藥材分別粉碎，過60目篩，按2.3.1方法測(cè)定總黃酮含量及體外抗氧化活性。結(jié)果見圖8，9。

圖8 不同藥用部位諸葛菜總黃酮含量比較

圖9 不同藥用部位諸葛菜抗氧化活性比較

由圖8可知，不同藥用部位諸葛菜總黃酮含量：葉>花>莖>根>果實(shí)，由圖9可知，不同藥用部位諸葛菜總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力均隨著樣品溶液濃度增大而增加，在10～50μg/ml增長(zhǎng)幅度較大，超過50μg/ml時(shí)，逐漸趨于平緩。由此可知，葉的總黃酮含量及抗氧化活性最高。

2.3.4不同干燥方法諸葛菜總黃酮含量及抗氧化活性比較 將置于不同干燥方法下干燥后的大花期諸葛菜藥材粉碎，過60目篩，按2.3.1方法測(cè)定總黃酮含量及體外抗氧化活性。結(jié)果見圖10，11。

圖10 不同干燥方法諸葛菜總黃酮含量比較

圖11 不同干燥方法諸葛菜抗氧化活性比較

由圖10可知，不同干燥方法諸葛菜總黃酮含量：低溫鼓風(fēng)干燥>微波干燥>陰干，由圖11所示，不同干燥方法諸葛菜總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力在10～50μg/ml范圍內(nèi)呈較好的量效關(guān)系。陰干法清除能力可達(dá)84.96%，微波干燥法為83.58%，低溫鼓風(fēng)干燥為81.76%。雖然陰干法抗氧化活性最高，但總黃酮含量相對(duì)較低；低溫干燥法和微波干燥法抗氧化活性差異較小，其中，陰干法總黃酮含量相對(duì)較高，因微波干燥法所需時(shí)間較短，因此選擇微波法作為諸葛菜最佳干燥方法。

3 討論

本課題在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化諸葛菜總黃酮超聲提取工藝，試驗(yàn)結(jié)果表明：在料液比1∶50、超聲時(shí)間51min、超聲溫度38℃、乙醇濃度68%條件下，諸葛菜中總黃酮含量為21.83mg/g，與模型預(yù)測(cè)值基本相近，從而說明該方法可行。通過對(duì)比不同干燥方法，不同藥用部位和不同生長(zhǎng)期諸葛菜總黃酮含量和抗氧化活性，選擇微波法干燥，葉和花蕾期總黃酮含量和抗氧化活性相對(duì)較高。本文通過對(duì)諸葛菜總黃酮提取工藝及抗氧化活性的研究，為諸葛菜有效成分的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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