張 倩 郭利偉 劉亞靜 張詠鶴 徐光華 黃艷梅

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)院， 新鄉(xiāng) 453003)

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組可以參與到結(jié)締組織的破壞與重構(gòu)的酶家族。目前人們已經(jīng)進(jìn)行了大量關(guān)于MMPs基因多態(tài)性的研究，其中包括動脈粥樣硬化、腦栓塞和腫瘤等，但關(guān)于心力衰竭(chronic heart failure,CHF)方面的研究比較少[1-2]。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)，rs243866位點A等位基因可降低MMP-2轉(zhuǎn)錄活性，從而可以降低CHF的發(fā)生易感性[3]；而rs17576位點AG基因型可以引得精氨酸至谷氨酰胺的氨基酸變化，進(jìn)而增加個體CHF發(fā)病風(fēng)險[4]；此外，rs1799750位點的1G等位基因以及單體型1G6A會降低個體CHF發(fā)病風(fēng)險[5]。雖然在人類的心肌組織中存在著多種MMPs,但當(dāng)CHF發(fā)生時并不是每一種MMPs都會升高。我們查閱中國國際人類基因組單體型圖計劃(簡稱HapMap計劃)數(shù)據(jù)庫以及美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的dbSNP數(shù)據(jù)庫又篩選出MMPs基因啟動子區(qū)rs225207、rs2285053、rs243865、rs11225395及rs11568818 5個SNPs，探討與CHF發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇收治到新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院的160例慢性CHF患者為觀察組，其中男84例，女76例，年齡58～79歲，平均年齡(61.1±8.5)歲。以同期住院的非CHF心臟病患者(同時除去其患有感染性，血液性、肝腎功能不全、惡性腫瘤等疾病)186例為對照組，其中男97例，女89例，其年齡52歲～78歲，平均年齡(60.7±8.7)歲，所有對象知情同意并簽署同意書，且均為三代以上居住在河南新鄉(xiāng)地區(qū)。

1.2 主要儀器與試劑

凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)、Qubit核酸蛋白定量分析試劑盒(Invitrogen生物公司)、PCR儀(Biometra公司，德國)、臺式高速冷凍離心機(jī)(Eppendoff公司，德國)、Taq酶(上海生物工程有限公司)、SNPs位點擴(kuò)增引物(Invitrogen生物公司)、多功能電泳儀(Phannacia公司，瑞典)、限制性內(nèi)切酶Hinf I、Xsp I、EcoR I、BglⅡ。

1.3 方法

1.3.1資料收集 所有研究對象統(tǒng)一填寫調(diào)查表，再由監(jiān)督人員核驗每一份調(diào)查表，確保信息無誤。

1.3.2生化指標(biāo)測定 空腹10 h過夜后，清晨6:00取受試者外周靜脈血8 ml，其中3 ml用于血脂等生化指標(biāo)測定、5 ml用于基因組DNA提取。采用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行血生化指標(biāo)檢測，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗科完成并進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3.3外周血基因組DNA的提取與定量分析 采用有機(jī)酚/氯仿法提取外周血基因組DNA，Qubit核酸蛋白定量分析試劑盒檢測所提取DNA的質(zhì)以及量，然后保存到-20℃冰箱備用。

1.3.45個SNPs目的片段PCR反應(yīng)體系 包含10×Buffer，1.5mmol/L MgCl2， 0.2mmol/L dNTPs，10μmol/L引物，50ng～100ng DNA模版，1U Taq Plus DNA聚合酶，總體積共為25μl。熱循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性2min后，94℃變性45s，退火溫度變異范圍(見表1)45s，72℃延伸45s，共計32個循環(huán),最后72℃延伸10min。

表1 MMPs基因5個SNPs位點基本信息

1.3.55個SNPs等位基因及基因型分型 采用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術(shù)對SNPs進(jìn)行分型。酶切反應(yīng)總體系10：其中包含PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5.0，相應(yīng)的內(nèi)切酶1U，1×內(nèi)切酶緩沖液，最后超純水補(bǔ)充，然后37℃水浴16h；6%聚丙烯酰胺凝膠(polacryamide gel electrophoresis，PAGE)電泳檢測酶切產(chǎn)物取3.0電泳上樣，同時加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(未經(jīng)酶切)以及500bp DNA Marker作為內(nèi)參，恒壓400V，1h(各SNPs所用限制性內(nèi)切酶見表1)，硝酸銀染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SHEsis軟件比較每個SNP點在觀察組與對照組間頻率以及頻數(shù)分布，OR和95%可信區(qū)間(95%CI)、樣本的群體代表性應(yīng)用Hardy-Weinberg平衡表示，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMPs基因型分布Hardy-Weinberg平衡

MMPs基因啟動區(qū)5個SNP位點各基因型在對照組中Hardy-Weinberg平衡結(jié)果表明，rs2285053、rs11225395及rs225207這3個SNP的基因型頻率在觀察組和對照組人群中符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，其中rs2285053位點χ2=0.05，P=0.95；rs11225395位點χ2=012，P=0.88；rs225207位點χ2=0.09，P=0.90。本文中rs243865位點基因型全部為CC，rs11568818位點基因型全部為AA，可能該位點在河南漢族人群中無多態(tài)性，因此不予分析。

2.2 MMPs基因啟動子區(qū)5個SNPs與CHF的相關(guān)性分析

2.2.15個SNPs分型及PCR-RFLP結(jié)果 本研究根據(jù)電泳圖譜出現(xiàn)條帶判定基因型。本次研究中rs243865、rs11568818未表現(xiàn)出多態(tài)性。而rs2285053、rs11225395、rs225207這3個SNPs位點等位基因電泳圖譜如圖1-3。5個SNPs位點引入的酶切位點及內(nèi)切酶。見表2。

表2 MMPS上5個SNPs位點等位基因及內(nèi)切酶

注：1 PCR產(chǎn)物；2 TT；3 CT；4 CC；5 空白對照

圖1 rs2285053等位基因PAGE電泳圖譜

注：1 PCR產(chǎn)物；2 TT；3 CC；4 CT；5 空白對照

圖2 rs11225395等位基因PAGE電泳圖譜

注：1 PCR產(chǎn)物；2 AA；3 AG；4 GG；5 空白對照

圖3 rs225207等位基因PAGE電泳圖譜

2.2.25個SNPs等位基因和基因型頻率 MMPs基因啟動子區(qū)5個SNPs的多態(tài)性與CHF的相關(guān)性如表3、4。結(jié)果顯示觀察組rs225207的等位基因A的頻率顯著降低(P<0.05)，rs2285053位點T等位基因兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；AA基因型在兩組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；rs11225395位點的T等位基因的頻率在觀察組明顯降低(P<0.05)，TT基因型頻率降低(P<0.05)；rs243865及rs11568818這兩個SNPs位點的在兩組基因型完全一樣沒有多態(tài)性，在此不予分析。

2.2.3MMPs上3個SNPS位點單倍型 用SHEsis軟件統(tǒng)計分析，推斷出rs2285053、rs11225395及rs225207構(gòu)建成8種單體型，通過進(jìn)一步比較，結(jié)果顯示，單體型CCG的頻率在兩組間存在顯著差異(P<0.05)。見表5。

表3 MMPs基因啟動區(qū)5個SNPs位點基因型在兩組中的頻率分布(n/%)

注：與對照組相比，*P<0.05

表4 MMPs基因啟動區(qū)5個SNPs位點等位基因在兩組中的頻率分布(n/%)

注：與對照組相比，*P<0.05

表5 MMPs基因啟動區(qū)3個SNPs位點單倍型分析(%)

注：與對照組相比，*P<0.05

3 討論

CHF是常見的臨床綜合癥，是目前心血管系統(tǒng)疾病患者生活質(zhì)量低下及死亡的重要原因之一[6]。CHF病因和發(fā)病機(jī)制仍在進(jìn)一步的研究當(dāng)中，其中基因多態(tài)性已成為研究熱點[7]。MMPs是一類ECM降解所必需的蛋白水解酶，可以參與到多種疾病的形成當(dāng)中，尤其是心血管疾病。隨著臨床和實驗室研究的不斷深入，已發(fā)現(xiàn)MMPs與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，并且其受基因調(diào)控[8]。

MMP-2幾乎存在于所有心肌細(xì)胞，研究表明MMP-2可降解肌鈣蛋白，損傷心肌收縮力。CHF患者M(jìn)MP-2水平的改變與死亡率有著直接關(guān)系[9]，故針對如何改變MMP-2活性從而影響CHF發(fā)病率的研究也越來越多。本文結(jié)果顯示，在河南新鄉(xiāng)地區(qū)漢族群體中觀察組rs2285053位點T等位基因的頻率與對照組相比降低。分析其原因可能是rs2285053位點C/T等位基因的改變，可以使基因啟動子區(qū)的Sp1位點的特異性序列變化，進(jìn)而影響MMP-2基因轉(zhuǎn)錄水平[10]，減少損害心肌肌原纖維的作用，降低個體CHF危險患病風(fēng)險。

研究證實MMP-8的ApoE基因敲除后會減少小鼠動脈粥樣硬化的程度，降低血清血管緊張素II水平，并在病變血管處細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)減少[11]。本文得出觀察組rs11225395位點的T等位基因的頻率與對照組相比降低(P<0.05)，OR=1.966,提示T等位基因降低個體CHF危險?；蚬δ軐W(xué)提示rs11225395基因位于MMP-8基因第2外顯子，C-T的替換可引起MMP-8的前肽結(jié)構(gòu)中第87位氨基酸谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼幔瑥亩沟肕MP-8的轉(zhuǎn)錄活性增高2～3倍，使得細(xì)胞外基質(zhì)分解明顯增加[12]，從而降低了心力衰竭的易感性。

研究表明，MMP-13在某種程度上使MMP-2和MMP-9激活，進(jìn)而可以破壞ECM和直接損害心肌，但也可以導(dǎo)致纖維連接素以及膠原蛋白降解，產(chǎn)生抑制心肌纖維化的作用[13]。本文結(jié)果顯示，觀察組rs225207的G等位基因的頻率與對照組相比明顯增加(P<0.05)。隨著G等位基因頻率的增加，間接下調(diào)了MMP-13轉(zhuǎn)錄水平，可能增加個體CHF危險。

多個SNP可能會降低單個位點對該疾病的影響，也可能會聯(lián)合誘發(fā)疾病。我們使用SHEsis分析rs17860523、rs11225395及rs225207之間的連鎖作用,及其與河南漢族群體CHF之間的相關(guān)性。得出三者一共構(gòu)建成8種單體型，各個單體型在兩組頻率均>0.01，結(jié)果顯示單體型CCG的頻率在兩組中比較差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)，OR=2.854(95%CI=1.690～4.820)，相比單個SNP的研究更加有意義。說明單體型CCG可能是CHF個體的預(yù)后不良因素之一，而其他觀察到的單體型可能與CHF個體預(yù)后沒有相關(guān)性(P>0.05)。

綜上所述，本文提示在河南新鄉(xiāng)地區(qū)漢族群體中rs225207位點的G等位基因及rs2285053、rs11225395及rs225207組成的單體型CCG可能會增加CHF的患病風(fēng)險；rs11225395、rs2285053位點的T等位基因可能會降低CHF的患病風(fēng)險；而rs243865、rs11568818這兩個位點在河南新鄉(xiāng)地區(qū)漢族群體中無多態(tài)性。

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