王麗萍, 張麗梅, 侯思遠, 徐 佳, 隋天卓, 張瑞寧, 王琪菲, 王立成

(1. 吉林大學 生命科學學院, 長春 130012; 2. 新時代健康產(chǎn)業(yè)(集團)有限公司, 北京102206; 3. 吉林大學 化學學院, 長春 130012)

瑪咖(Maca)又名瑪卡, 屬于十字花科一年生草本植物. 葉子橢圓, 根莖肥厚, 下胚軸與根融合, 形成一個粗糙倒梨形的塊根[1]. 瑪咖的藥用價值及營養(yǎng)成分隨生長環(huán)境的不同而不同. 瑪咖作為一種純天然食品, 富含大量營養(yǎng)素, 其下胚軸部分可作為藥物或食物, 具有“藥食同源”的雙重功效. 瑪咖干根內(nèi)含豐富的礦物質(zhì), 并含豐富的維生素C、 維生素B族(B1,B2,B5,B6,B12)、 維生素A、 維生素E、 碳水化合物、 不飽和脂肪酸、 亞油酸和亞麻酸、 蛋白質(zhì)和纖維等[2]. 瑪咖中的氨基酸與鋅、 鐵、 牛磺酸等成份可改善人體生理機能, 并提高人體免疫力[3-5]. 瑪咖中天然活性成份以生物堿類物質(zhì)和芥子油苷為主[6-8], 芥子油苷的分解產(chǎn)物異硫氰酸芐酯、 甾醇、 多酚也是生物活性物質(zhì), 應用廣泛[9-10]. 下丘腦和腦垂體是瑪咖中生物堿的主要作用靶點, 瑪卡烯、 瑪卡酰胺對改善性功能、 提高精子數(shù)量有顯著功效, 對睪丸、 卵巢具有調(diào)節(jié)作用, 通過平衡機體荷爾蒙水平進一步穩(wěn)定內(nèi)分泌系統(tǒng)[11]. 此外, 瑪咖可改善因壓力導致的憂慮癥和神經(jīng)衰弱.

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans, 線蟲)是典型的抗氧化、 抗衰老研究模型, 其成蟲多為自我繁殖的雌雄同體, 20 ℃平均壽命為18～20 d. 幼蟲期線蟲是衡量藥物對發(fā)育影響的關鍵時期； 成蟲期線蟲常用于評估藥物毒性以及基因表達的研究[12]. 線蟲壽命、 產(chǎn)卵量、 吞咽率及運動能力是衡量線蟲正常生理活動的關鍵指標, 也是評估待篩選藥物毒性作用的關鍵指標. 線蟲體內(nèi)存在過氧化現(xiàn)象, 在生理表型上會隨時間的推移表現(xiàn)出不同程度的衰老表型, 如移動程度緩慢, 身體肥大臃腫, 泄殖腔堵塞, 不能正常排卵、 生殖, 咽部收縮程度降低, 進食量減少, 體表表皮老化, 色素沉著等現(xiàn)象, 預示線蟲進入衰老期, 機體內(nèi)自由基穩(wěn)態(tài)失衡. 因此， 線蟲是初步篩選抗衰老藥物的首選模型[13].

本文以瑪咖為原料, 通過水提法進行提取、 純化, 以模式生物秀麗隱桿線蟲的典型抗氧化指標為標準, 研究瑪咖水提物的抗氧化作用功效.

1 材料與方法

1.1 儀 器

電子分析天平(BT25S型, 德國Sartorius公司)； 數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型, 上海比朗儀器有限公司)； 高壓滅菌鍋(日本SANYO公司)； 電熱鼓風干燥箱(南京實驗儀器廠)； 高速低溫離心機(Centrifuge 58-10R型, 德國Eppendorf公司)； 數(shù)控超聲清洗儀(KQ300DE型, 昆山市超聲儀器有限公司)； 凍干機(ALPHA2-4型, 德國CHIST公司)； 制冰機(SIM-R124型, 日本SANYO公司)； 生化培養(yǎng)箱(SHP-160型, 上海三發(fā)科技儀器有限公司)； 超凈工作臺(SW-CJ-1FD型, 蘇州凈化設備有限公司)； 光學顯微鏡(上海精密科學儀器有限公司)； 手動移液器(德國Eppendorf公司)； 冰箱(BCD-139GY型, 韓國三星/中國海爾公司).

1.2 材 料

缺陷型大腸桿菌(EscherichiacoliOP50)； 野生型秀麗隱桿線蟲(BristolN2)購自美國Caenorhabditis Genetics Center； 瑪咖購自新時代健康產(chǎn)業(yè)(集團)有限公司.

1.3 試 劑

胰蛋白胨、 酵母提取物(英國OXOID公司)； 無水乙醇、 氯化鈣、 氯化鈉、 硫酸鎂、 磷酸氫二鈉、 磷酸二氫鉀(分析純, 北京化工廠)； 體積分數(shù)為30%的過氧化氫(北京化工廠)； 氯化鉀、 碳酸氫鈉、 瓊脂粉(北京鼎國昌盛生物公司); 膽固醇(分析純, 上海化學試劑公司)； 次氯酸鈉溶液(天津南開化工廠)； 油紅O(大連美侖生物技術有限公司).

1.4 方 法

1.4.1 瑪咖活性成分提取 將粒徑小于60目的瑪咖粉末溶于碳酸氫鈉溶液, 進行脫油處理后, 置于恒溫干燥箱進行干燥脫水. 先稱取3.0 g瑪咖干粉溶于50 mL水溶液, 攪拌混勻, 再轉(zhuǎn)移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱于300 r/min震蕩24 h. 將固液混合溶液置于高速冷凍離心機, 于4 000 r/min離心8 min, 取上清液； 提高轉(zhuǎn)速, 再次離心以降低上清液中雜質(zhì)含量, 于8 000 r/min離心30 min, 取上清液. 將上清液置于廣口皿中-80 ℃冰箱冷凍48 h. 待冷凍完全后轉(zhuǎn)移至預冷的凍干機內(nèi)凍干. 用E.coliOP50菌液(OD600=0.4～0.6)稀釋瑪咖水提物干粉至終質(zhì)量濃度為1,2 mg/mL(現(xiàn)用現(xiàn)配)； 相同質(zhì)量濃度E.coliOP50為對照組.

1.4.2 線蟲生理指標評估實驗 線蟲實驗均采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲, 同期化的卵開始記為0 d, 給藥當天根據(jù)線蟲年齡標記. 待線蟲由卵成長至L4期, 進行給藥處理, 在正常培養(yǎng)條件下(非壓力誘導條件), 線蟲在長有E.coliOP50菌膜的線蟲培養(yǎng)基(NGM)表面培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為20 ℃恒溫孵育. 實驗過程中每天轉(zhuǎn)移線蟲至新鮮的培養(yǎng)基中, 觀察線蟲的狀態(tài), 記錄存活、 死亡及丟失數(shù)量, 觀察線蟲生長狀態(tài). 統(tǒng)計結(jié)果重復3次以上, 用Prism GraphPad5軟件分析.

1) 線蟲的生理指標評估. 線蟲壽命實驗: 每個實驗組50只線蟲, 每天轉(zhuǎn)移線蟲至新鮮的培養(yǎng)基中, 觀察線蟲的狀態(tài), 記錄存活、 死亡及丟失數(shù)量, 觀察線蟲生長狀態(tài)至全部死亡； 線蟲產(chǎn)卵量實驗: 每個實驗組5只線蟲, 統(tǒng)計線蟲每日產(chǎn)卵數(shù)量至線蟲不再產(chǎn)卵； 線蟲吞咽能力實驗: 每個實驗組5只線蟲, 統(tǒng)計每只線蟲每分鐘咽部的收縮次數(shù)至線蟲生命晚期； 線蟲運動能力實驗: 每個實驗組70只線蟲, 每天轉(zhuǎn)移線蟲至新鮮的培養(yǎng)基中, 觀察線蟲的運動狀態(tài), 將其移動表現(xiàn)劃分為具有正常的運動能力, 僅在觸碰時有應激運動, 僅在挑蟲器觸碰條件下有輕微頭部運動和死亡4個運動等級[14].

2) 線蟲體外熱激氧化壓力評估. 實驗同期化的L4期線蟲給藥3 d后, 轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中； 平板密封, 于35 ℃熱激； 每小時均計數(shù)統(tǒng)計存活率, 以響應觸碰的線蟲數(shù)與線蟲總數(shù)的比值表征. 其中爬到側(cè)壁上脫水而死的記為丟失, 不參與統(tǒng)計. 實驗重復3次, 每次每組30只線蟲.

3) 線蟲油紅O脂肪染色. 將同期化的對照組和給藥組線蟲在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 從蟲齡第4天起, 收集線蟲進行樣品固定和染色； 用體積分數(shù)為1%的多聚甲醛固定線蟲； 先于-80 ℃冰箱冷凍15 min后, 再于43 ℃水浴中迅速解凍； 用M9緩沖溶液(buffer)洗去甲醛； 加入體積分數(shù)為60%的異丙醇, 使線蟲脫水, 15 min后洗去異丙醇溶液； 加入體積分數(shù)為60%的油紅O染色30 min； 用M9 buffer反復沖洗6次； 用含體積分數(shù)為0.01% Tween的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行脫色處理； 將線蟲轉(zhuǎn)移至NGM平皿表面, 隨機挑取15～20只線蟲用于脂肪染色觀察； 體積分數(shù)為2%的瓊脂制片， 顯微鏡下觀察并拍照.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)采用Prism GraphPad5軟件進行統(tǒng)計分析, Kaplan-Meier方法生成存活曲線. 顯著性檢驗采用Log-rank (Mantel-Cox) Test分析計算, **P<0.01, 表示顯著差異; ***P<0.001, 表示極顯著差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲的生理指標評估

圖1 瑪咖水提物對線蟲壽命的影響Fig.1 Effects of water extracts of Maca on lifespan C.elegans

2.1.1 線蟲壽命實驗 線蟲壽命的測定是評價線蟲生理狀態(tài)最直觀、 最具參考價值的指標之一, 是衡量線蟲生長狀態(tài)、 外界藥物毒性評估的重要參考依據(jù). 本文選用野生型N2線蟲進行壽命測定實驗, 對照組為OP50組, 梯度給藥組為1,2 mg/mL的瑪咖水提物, 結(jié)果如圖1所示. 不同質(zhì)量濃度瑪咖水提物對線蟲壽命的影響列于表1. 由圖1和表1可見, 不同質(zhì)量濃度瑪咖水提物均可延長線蟲的壽命, 其中2 mg/mL瑪咖壽命延長效果最顯著, 平均壽命提高27.3%. 這種壽命延長作用與對照組相比差異顯著, 但并未呈良好的劑量依賴性.

表1 不同質(zhì)量濃度瑪咖水提物對線蟲壽命的影響

2.1.2 線蟲產(chǎn)卵量實驗 線蟲產(chǎn)卵量的高低是衡量線蟲繁殖能力的參考依據(jù), 也是對其營養(yǎng)、 身體狀況進行評價的標準. 圖2為1,2 mg/mL瑪咖水提物對線蟲產(chǎn)卵量的影響. 由圖2可見, 瑪咖水提物喂食組線蟲產(chǎn)卵量呈先增多、 后降低的趨勢, 與對照組趨勢相同, 其中2 mg/mL組產(chǎn)卵量相對最高. 表2為瑪咖水提物喂食線蟲日產(chǎn)卵量統(tǒng)計分析結(jié)果. 由表2可見, 瑪咖高濃度組高于低濃度組和對照組的產(chǎn)卵量, 較對照組平均產(chǎn)卵量增長12.72%, 而1 mg/mL瑪咖較對照組平均產(chǎn)卵量增長9.79%. 可見瑪咖水提物對線蟲產(chǎn)卵量的影響存在濃度依賴性, 且具有一定的促產(chǎn)卵作用.

表2 瑪咖水提物喂食線蟲日產(chǎn)卵量統(tǒng)計分析

2.1.3 線蟲吞咽能力實驗 線蟲吞咽能力是線蟲對藥物攝取情況的監(jiān)控, 是判斷線蟲壽命、 產(chǎn)卵等指標是否由攝入能量不足而導致“熱量限制”引起的. 年輕的成蟲平均每分鐘抽吸250～300次, 隨著年齡增長逐漸減慢. 圖3為1,2 mg/mL瑪咖水提物喂食線蟲1～5 d的吞咽率統(tǒng)計結(jié)果. 由圖3可見, 瑪咖水提物喂食組線蟲與對照組的吞咽率相比差異較小, 表明瑪咖對線蟲生理指標的影響不是由熱量限制導致的, 而是由藥物作用所致.

圖2 瑪咖水提物對線蟲產(chǎn)卵量的影響Fig.2 Effects of water extracts of Maca on egg production of C.elegans

圖3 瑪咖水提物對線蟲吞咽率的影響Fig.3 Effects of water extracts of Maca on swallowing rate of C.elegans

2.1.4 線蟲運動能力實驗 由于外界藥物對線蟲刺激的狀態(tài)不同, 因此對線蟲運動存在一定影響. 對線蟲運動能力評估, 可直觀體現(xiàn)線蟲處于生命周期的具體時期, 使線蟲衰老進程更直觀. 圖4為不同質(zhì)量濃度瑪咖水提物喂食線蟲1～3 d的運動能力統(tǒng)計結(jié)果. 由圖4可見, 瑪咖喂食組線蟲2 mg/mL組對線蟲運動能力影響較小, 優(yōu)于對照組.

2.2 線蟲熱激實驗

線蟲熱激實驗是通過給線蟲體外熱刺激, 誘導線蟲體內(nèi)的應激抵抗反應, 使線蟲體內(nèi)的應激蛋白、 抗熱、 耐熱蛋白過表達, 從而提高自身耐受能力. 線蟲熱激實驗可直觀衡量在藥物保護作用下線蟲抵抗不良熱環(huán)境的能力, 并衡量藥物對熱刺激導致體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生的保護作用. 圖5為不同質(zhì)量濃度瑪咖水提物喂食線蟲抗熱激能力誘導的統(tǒng)計結(jié)果. 水提物通過Log-rank (Mantel-Cox) Test分析計算表明, 喂食組與對照組無顯著差異(P>0.05).

a. 對照組; b. ρ(Maca)=1 mg/mL組；c. ρ(Maca)=2 mg/mL組.圖4 不同質(zhì)量濃度瑪咖水提物對線蟲運動能力的影響Fig.4 Effects of different mass concentrations of water extracts of Maca on motor ability of C.elegans

圖5 瑪咖水提物對熱激氧化壓力下線蟲的保護作用Fig.5 Protective effects of water extracts of Maca on C.elegans under hot-oxidative stress

2.3 線蟲油紅O染色實驗

線蟲個體微小, 全身透明, 通過油紅O染色法對線蟲進行脂肪染色, 可評價線蟲體內(nèi)脂肪累積效果及脂代謝效果. 圖6為不同質(zhì)量濃度的瑪咖水提物對線蟲脂肪堆積的影響. 由圖6可見, 喂食瑪咖水提物的線蟲其油紅O脂肪染色程度較淺. 圖7為油紅O染色線蟲脂肪的統(tǒng)計結(jié)果. 由圖7可見, 在相同實驗條件下, 瑪咖水提物對線蟲有一定的降脂作用.

圖6 瑪咖水提物對線蟲脂肪堆積的影響Fig.6 Effects of water extracts of Maca on fat accumulation of C.elegans

a. 對照組; b. ρ(Maca)=1 mg/mL組； c. ρ(Maca)=2 mg/mL組.圖7 油紅O染色線蟲脂肪的統(tǒng)計結(jié)果Fig.7 Statistical results of oil red O staining for fat of C.elegans

綜上, 本文以天然植物瑪咖為原料, 經(jīng)水提工藝提取, 以秀麗隱桿線蟲為模型研究了瑪咖的作用功效. 通過對線蟲壽命、 產(chǎn)卵量、 吞咽能力、 運動能力評估, 確定瑪咖水提物存在顯著延長線蟲壽命的作用, 數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學意義, 且瑪咖對線蟲毒性作用較低, 不影響線蟲的正常生理功能和生命活動. 本文結(jié)果可為瑪咖在醫(yī)療保健領域的進一步開發(fā)應用提供重要參考價值及新思路.

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