(青島大學(xué)附屬醫(yī)院牙周病科，山東 青島 266003)

牙周炎是目前全球范圍內(nèi)最普遍的慢性疾病之一[1-2]。該病人群患病率較高，且往往在晚期才會(huì)被診斷出來，因此嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并給患者增加極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而引起牙周炎的始動(dòng)因素便是菌斑生物膜(菌膜)[3-4]。菌膜微環(huán)境具有獨(dú)特的特征，其pH值可以達(dá)到4.5，甚至更低[5]，此外表面帶有大量的負(fù)電荷[6]，因此，設(shè)計(jì)一種靶向性的能夠吸附在菌膜表面并且對菌膜的低 pH環(huán)境有響應(yīng)性的納米粒子，是破壞菌膜、殺死菌膜內(nèi)菌體的有效方式。季銨鹽殼聚糖是殼聚糖的衍生物，因帶有永久的正電荷而使其本身具有較高的抑菌活性[7]。脂質(zhì)體是一種帶負(fù)電囊泡狀結(jié)構(gòu)的生物材料，具有與多種物質(zhì)結(jié)合的能力，被廣泛作為藥物輸送載體[8]。本實(shí)驗(yàn)選擇治療牙周病的首選藥物鹽酸多西環(huán)素作為模型藥物[9]，以帶負(fù)電荷脂質(zhì)體作為藥物載體，并以正電性的季銨鹽殼聚糖作為納米粒外殼旨在制備具有pH響應(yīng)性的季銨鹽脂質(zhì)體多西環(huán)素納米粒(TMC-Lip-DOX NPs)，通過牙周炎的厭氧菌體外抑菌試驗(yàn)測試TMC-Lip-DOX NPs的抑菌活性，通過牙周膜成纖維細(xì)胞測試其細(xì)胞相融性。從而探討該具有pH響應(yīng)性的TMC-Lip-DOX NPs作為口腔臨床用藥的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料來源

殼聚糖(相對分子質(zhì)量為150 000，脫乙酰度為85%)及蛋黃卵磷脂購自山東萊州海利生物制品有限公司。碘甲烷(CH3I)、二甲亞砜(DMSO)、氫氧化鈉(NaOH)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自青島云山生物科技有限公司。牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalisATCC33277)、中間普氏菌(P.intermediaATCC25611)和伴放線放線桿菌(A.actinomycetemcomitansY4)由中國海洋大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。牙周膜成纖維細(xì)胞(HPDLFs)由青島大學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供。噻唑藍(lán)(MTT)和研究中的其他化學(xué)試劑購自青島華盛化學(xué)試劑公司。SD大鼠購買自上海斯萊克有限公司。

1.2 pH響應(yīng)性納米粒的合成及其表征

1.2.1季銨鹽殼聚糖的制備 季銨鹽殼聚糖是在堿性的條件下將殼聚糖進(jìn)行甲基化作用而合成的[10-11]。稱取2 g殼聚糖粉末加入到40 mL二甲亞砜和6 mL NaOH(150 g/L)的混合溶液中，在室溫條件下攪拌一定的時(shí)間，然后加入12 mL的碘甲烷，60 ℃下反應(yīng)1 h。1 h后，再往燒瓶中加入適量的150 g/L的NaOH和CH3I，使其徹底反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加入無水乙醇出現(xiàn)白色沉淀后終止反應(yīng)，透析、凍干。即得水溶性的季銨鹽殼聚糖。

1.2.2脂質(zhì)體的制備 脂質(zhì)體采用薄膜蒸發(fā)法制得[12]。稱取質(zhì)量70 mg的蛋黃卵磷脂，加入體積比為1∶1的三氯甲烷和無水乙醇溶解，在35 ℃減壓的條件下蒸發(fā)干燥至形成均勻薄膜。加入5 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，其中溶有25 mg膽酸鈉和5 mg多西環(huán)素，在55 ℃的水浴中旋轉(zhuǎn)攪拌30 min，冰浴下超聲4次后，得到脂質(zhì)體納米?；鞈乙?。而且，水化過后，1 g/L的多西環(huán)素被包含在脂質(zhì)體囊泡中。

1.2.3TMC-Lip-DOX NPs制備 將0.5 g/L的季銨鹽殼聚糖溶液緩慢滴加到等體積包載多西環(huán)素脂質(zhì)體乳液中，滴加完成后繼續(xù)攪拌一定時(shí)間，超聲后得到TMC-Lip-DOX NPs。

1.2.4TMC-Lip-DOX NPs粒徑大小、分布情況和形態(tài)檢測 使用激光粒度/Zeta電位分析儀分別測定游離脂質(zhì)體(A組)、pH 7.2環(huán)境下的季銨鹽脂質(zhì)體(B組)、pH 4.5環(huán)境下的季銨鹽脂質(zhì)體(C組)和pH 7.2環(huán)境下的TMC-Lip-DOX NPs(D組)的粒徑大小及分布情況，并在透射電子顯微鏡下觀察納米粒形態(tài)。

1.3 菌斑生物膜的形成

將牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和伴放線放線桿菌分別置于TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)待用。隨后將3種菌液等體積混合后再用培養(yǎng)基將混合后的菌液稀釋至1×109CPU/L，并滴加至放有羥基磷灰石片的6孔板內(nèi)，并于37 ℃嚴(yán)格厭氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h[13]，羥基磷灰石片上即得混合菌斑生物膜。

1.4 TMC-Lip-DOX NPs對游離混合菌抑菌活性

采用MTT法檢測納米粒對游離混合菌的抑菌活性。將牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和伴放線放線桿菌混合后的菌液稀釋至1×108CPU/L。取200 μL稀釋后的細(xì)菌懸液分別與等體積的培養(yǎng)基溶液(A組)、季銨鹽溶液(B組)、多西環(huán)素溶液(C組)、季銨鹽脂質(zhì)體溶液(D組)和TMC-Lip-DOX NPs溶液(E組)混合，并分別滴加至96孔板中培養(yǎng)24 h。隨后加入含0.5 g/L 的MTT的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基后加入100 μL的DMSO，10 min后用酶標(biāo)儀在波長492 nm處測定其吸光度(A)值。以相同方法重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 TMC-Lip-DOX NPs對菌斑生物膜抑菌效果

待羥基磷灰石片上的菌斑生物膜形成后，去除6孔板內(nèi)的菌液并分別加入2 mL的PBS緩沖液(A組)、季銨鹽溶液(B組)、多西環(huán)素溶液(C組)以及TMC-Lip-DOX NPs溶液(D組)共培養(yǎng)24 h。隨后用5-DTAF對菌斑生物膜進(jìn)行染色，并用熒光顯微鏡對其生物膜進(jìn)行觀察。同樣以相同方法重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次，觀察結(jié)果。

1.6 細(xì)胞相容性檢測

選用HPDLFs體外以MTT法檢測TMC-Lip-DOX NPs細(xì)胞相融性[14]。將密度為1×108個(gè)/L的細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)12 h后，棄去原液，用PBS洗滌2次后，分別更換為含體積分?jǐn)?shù)0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5和0.031 25的TMC-Lip-DOX NPs，繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。陰性對照組加入相同體積的空白培養(yǎng)基。隨后，每孔加入10 μL濃度為5 g/L的MTT液，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h。棄去培養(yǎng)基以后加入150 μL DMSO溶解10 min，使甲瓚晶體完全溶解，采用紫外分光光度計(jì)檢測波長490 nm處的吸光度(A)值。相對生長速率用以下方程式表示：相對生長速率(%)=Dt/Dnc×100%，Dt和Dnc分別指測試樣品的吸光度值和陰性對照的吸光度值。

1.7 TMC-Lip-DOX NPs體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)[15]

選取20只大鼠(雌雄各半)，體質(zhì)量為(152.6±18.4)g，隨機(jī)分成對照組和實(shí)驗(yàn)組(n=10)。實(shí)驗(yàn)組單次灌胃10 mL/kg的TMC-Lip-DOX NPs溶液，對照組單次灌胃相同劑量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。隨時(shí)記錄大鼠的行為活動(dòng)狀態(tài)，觀察是否有呼吸困難、腹瀉、眼瞼下垂等中毒癥狀或死亡。1周后頸部脫臼法處死大鼠，并完整取出其心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，浸泡在40 g/L中性甲醛溶液中，24 h后脫水、包埋、切片、HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織有無病理改變。

2 結(jié) 果

2.1 TMC-Lip-DOX NPs的表征

從外觀上看，合成的TMC-Lip-DOX NPs為乳白色渾濁液體(圖1A)，超聲后略變澄清(圖1B)。透射電鏡觀察粒子的形態(tài)并拍攝照片，包載多西環(huán)素的脂質(zhì)體為類圓形，季銨鹽包裹后使部分脂質(zhì)體聚集在一起，直徑明顯增大(圖2)。采用激光粒度/Zeta電位分析儀測量的不同成分納米粒及納米粒不同pH環(huán)境下的直徑、分散系數(shù)和電動(dòng)電位的結(jié)果如表1所示。在同一pH值環(huán)境下(pH 7.2)，覆蓋上季銨鹽后(季銨鹽脂質(zhì)體納米粒)直徑明顯增大,電位升高(B組)。當(dāng)改變pH環(huán)境(pH 4.5)，季銨鹽脂質(zhì)體納米粒電位反轉(zhuǎn)為正電荷,并且隨著pH值的降低，納米粒的直徑增加(C組)。在pH為7.2的環(huán)境下，加載多西環(huán)素得到的TMC-Lip-DOX NPs(D組)，其直徑有了顯著增大(F=36.98,P<0.01)，電位有了顯著增高(F=39.88，P<0.01)，而各組之間的分散系數(shù)無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.2 TMC-Lip-DOX NPs對游離混合菌的抑菌活性

對各實(shí)驗(yàn)分組的吸光值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，A、B、C、D、E組的吸光值分別為1.64±0.13、1.27±0.19、0.99±0.23、1.34±0.15、0.48±0.04，與A組相比，季銨鹽、多西環(huán)素、季銨鹽脂質(zhì)體、TMC-Lip-DOX NPs均有不同程度的抑菌效果，不同組的藥物對相同混合菌的抑菌效果比較差異具有顯著性(F=49.87)，其中TMC-Lip-DOX NPs的抑菌效果優(yōu)于其他3種(P<0.01)。

圖1 TMC-Lip-DOX NPs形態(tài)外觀

A：80 kV,25 000倍，B：80 kV,150 000倍。

分組粒徑(D/nm)分散系數(shù)電位(V/mV)A組103．2±3．50．19±0．10-22．23±1．07B組128．9±3．20．29±0．12-10．08±1．02C組158．0±3．00．17±0．07 9．32±0．63D組172．0±3．60．22±0．06 13．35±1．02

2.3 TMC-Lip-DOX NPs對于菌斑生物膜的抑菌效果

羥基磷灰石片與混合細(xì)菌共同培養(yǎng)24 h以后，5-DTAF染色后封片觀察，菌斑生物膜24 h后形成，未經(jīng)處理的生物膜作為A組(圖3A)。季銨鹽、多西環(huán)素和TMC-Lip-DOX NPs的抗菌性能具有顯著差異。B、C組雖生物膜結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，但結(jié)構(gòu)仍然存在，未徹底分解，而C組破壞程度明顯大于B組(圖3B、C)。D組生物膜的結(jié)構(gòu)明顯破壞，細(xì)菌數(shù)量顯著減少，只有少量的游離細(xì)菌存在(圖3D)。

2.4 細(xì)胞相容性檢測

24 h條件下不同濃度TMC-Lip-DOX NPs作用下的細(xì)胞相對的生長速率分別為80.60%、88.14%、89.32%、98.88%、99.56%，48 h條件下不同濃度TMC-Lip-DOX NPs作用下的細(xì)胞相對生長速率分別為85.67%、87.90%、94.22%、98.10%、99.38%。不同濃度的TMC-Lip-DOX NPs作用下在不同時(shí)間段的細(xì)胞相對生長速率與陰性對照組比較差異均無顯著性(P>0.05)。

2.5 急性毒性檢測

連續(xù)1周灌胃給藥后，實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠行為狀態(tài)良好，均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，病理檢查各組大鼠的各內(nèi)臟器官，未發(fā)現(xiàn)明顯異常(圖4)。

A、B、C、D分別為A、B、C、D組。5-DTAF染色，10倍。

A、B、C、D、E分別代表對照組的心、肝、脾、肺、腎，A′、B′、C′、D′、E′分別代表實(shí)驗(yàn)組的心、肝、脾、肺、腎。HE染色，200倍。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以帶負(fù)電荷脂質(zhì)體作為包載多西環(huán)素的核心載體，使用季銨化修飾得到的正電性季銨鹽殼聚糖作為納米粒外殼，季銨鹽與脂質(zhì)體間通過靜電吸附作用而相互交聯(lián)，從而形成了具有pH響應(yīng)性的TMC-Lip-DOX NPs。當(dāng)納米粒通過電荷作用黏附在菌膜上，處于菌膜獨(dú)特的低pH環(huán)境時(shí)，季銨鹽殼聚糖中未進(jìn)行季銨化反應(yīng)的游離氨基發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)，從而使納米粒外殼攜帶更多的正電荷，因而降低了納米粒的穩(wěn)定性而激發(fā)了脂質(zhì)體內(nèi)多西環(huán)素在菌膜病灶處迅速釋放，以達(dá)到破壞菌膜，殺死病原菌的目的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TMC-Lip-DOX NPs在水溶液中分散均勻，呈近似圓形，脂質(zhì)體外包裹季銨鹽后粒徑明顯變大，一方面，季銨鹽包裹在脂質(zhì)體外，增加了其原本的直徑，另一方面，具有長鏈的陽離子TMC可以交聯(lián)多個(gè)脂質(zhì)體形成更大的顆粒[16]。當(dāng)外界溶液中pH值降低時(shí)，納米粒由原本的負(fù)電荷反轉(zhuǎn)為正電荷，且粒徑也隨之增大。分析其原因是，當(dāng)pH值降低后，脂質(zhì)體外層的季銨鹽發(fā)生質(zhì)子化，使其表面帶有更多正電荷，因而交聯(lián)更多脂質(zhì)體，使得納米粒的直徑明顯變大。

殼聚糖是天然的陽離子多糖，具有安全無毒、生物可降解的特點(diǎn)[17]。將殼聚糖進(jìn)行季銨化修飾能明顯增強(qiáng)其水溶性和抑菌性，并能夠攜帶永久正電荷，因而季銨基團(tuán)修飾的殼聚糖的抗菌活性高于傳統(tǒng)殼聚糖[18]。我們的實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果表明，使用改性殼聚糖作為納米粒外殼，能夠顯著地提高納米粒對菌膜的黏附性，并大大提高藥物的抑菌效率。針對TMC-Lip-DOX NPs對生物膜的作用機(jī)制，我們可歸納為三方面。第一，正電荷納米粒能通過靜電吸附作用聚集在帶負(fù)電荷的細(xì)菌生物膜表面[19-20]。第二，抗菌納米顆粒能有效滲透進(jìn)入菌斑生物膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜解體，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容外泄，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。生物膜具有胞外聚合物作為保護(hù)性矩陣，可以獲得對傳統(tǒng)抗生素的耐藥性，并阻止各種治療劑的有效傳遞[21-23]。第三，季銨鹽可以作為一種有效抑菌劑作用于菌膜內(nèi)的胞外聚合物，導(dǎo)致菌斑生物膜結(jié)構(gòu)破壞。這將促進(jìn)多西環(huán)素對細(xì)菌的抑菌作用。

對于TMC-Lip-DOX NPs的安全性試驗(yàn)，我們進(jìn)行了初步的研究，其中細(xì)胞相溶性實(shí)驗(yàn)和急性毒性實(shí)驗(yàn)是比較常用的實(shí)驗(yàn)方法[24-26]，用于避免材料應(yīng)用于人體后出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞相對生長速率沒有顯著性降低,形態(tài)良好,各不同濃度的TMC-Lip-DOX NPs組在各時(shí)間段相對生長速率與陰性對照組無顯著差異，表明TMC-Lip-DOX NPs與牙周膜成纖維細(xì)胞具有良好的細(xì)胞相容性。而病理結(jié)果表明，其對大鼠也無明顯的致毒作用，可初步說明此材料具有一定的安全性。對于臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)作用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)制得的TMC-Lip-DOX NPs粒徑較小，具有較強(qiáng)的抑菌作用，毒性小，大大提高了抗生素在體內(nèi)的作用效率，從而有助于減少臨床中抗生素的濫用，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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