薛思慧，張楓源，向 福，2*，張曉紅，項 俊，2

（1.經(jīng)濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

刺楸（Kalopanax septemlobus）為五加科刺楸屬落葉、闊葉喬木，植株多刺，是我國珍稀瀕危樹種[1-2]。刺楸嫩芽、嫩葉可食用，氣味清香，營養(yǎng)保健價值高，是一種綠色無污染的木本山野菜[3-4]；其根莖皮和花均可入藥，用于治療神經(jīng)痛、風濕骨痛及跌打損傷等[2，5]，集藥用食用于一體，是一種極具開發(fā)利用價值的野生植物資源。現(xiàn)代研究表明，刺楸功效成分主要是總皂苷，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗真菌、抗類風濕等功效活性[2，6-8]。程東巖等[9]發(fā)現(xiàn)刺楸葉中總皂苷含量高于樹皮，從而建議刺楸葉亦可入藥。

目前關于刺楸化學成分結構、藥理活性的研究較多[6-8，10]，對其莖皮中皂苷成分提取也有報道[11]，但其葉中皂苷的提取工藝及抗氧化活性鮮見報道。目前關于藥材中皂苷的提取在雖然引入了微波提取[12]、超聲提取[13]、超臨界流體萃取[14]等新型方法，但實際生產(chǎn)中仍是主要利用乙醇溶液進行滲漉、浸漬、回流、酶解等方法提取[15-16]。其中，酶通過改變中藥材細胞壁和細胞間質結構可顯著促進皂苷的提取[15，17]。

大別山地區(qū)野生刺楸資源豐富，大量的刺楸樹葉可供開發(fā)利用。本試驗以大別山地區(qū)的刺楸葉為原材料，采用酶法輔助乙醇提取總皂苷并對其進行抗氧化活性評價，以期為大別山刺楸植物資源的深加工和綜合利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺楸葉：采自大別山國家森林公園，陰干、粉碎備用；無水乙醇、甲醇（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；香蘭素、冰乙酸、L（+）-抗壞血酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；高氯酸（分析純）：天津市鑫源化工有限公司；人參皂苷Re標準品（純度≥98%，批號20161218）、纖維素酶（酶活≥1 800 U/mg，CAS 9012-54-8）：上海金穗生物科技有限公司；羥基自由基試劑盒（批號20170901）：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

FA2104電子分析天平：上海精細天平有限公司；Cary-100紫外可見分光光度計：美國Varian公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線及總皂苷提取率測定

根據(jù)文獻[18]的方法，精確稱取人參皂苷Re標準品0.005 0 g，用甲醇溶解并定容至5 mL，作為標準品溶液。分別取標準品溶液0.01mL、0.02mL、0.03mL、0.04mL、0.05mL、0.06 mL、0.07 mL、0.08 mL、0.09 mL、0.10 mL于具塞試管，水浴揮干溶劑后，加入0.20 mL現(xiàn)配的5%香草醛-冰乙酸溶液，0.80 mL高氯酸，60℃條件下水浴15 min，冰水冷卻，加入5 mL冰醋酸并搖勻，室溫條件下靜置20 min。測定波長546 nm處有最大吸收，空白對照為甲醇溶液。以人參皂苷Re的取樣質量（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，擬合標準曲線回歸方程為：A=5.340 8C-0.030 3，相關系數(shù)R2=0.999 3，表明人參皂苷Re取樣質量在0.01～0.10 mg范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。刺楸葉總皂苷提取率計算公式為：

式中：Y為總皂苷提取率，%；C為樣品中總皂苷質量，mg；N為稀釋倍數(shù)；m為刺楸葉的質量，g。

1.3.2 單因素試驗

稱取5份刺楸葉粉末各3 g置于圓底燒瓶，分別探究乙醇體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL））、纖維素酶添加量（刺楸葉質量0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%）、酶解溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80 ℃）和酶解時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）對刺楸葉中總皂苷提取率的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

為進一步優(yōu)化提取人參皂苷的工藝條件，在單因素試驗基礎上，選擇對總皂苷提取率影響比較顯著的酶解溫度（X1）、纖維素酶添加量（X2）和乙醇體積分數(shù)（X3）三個因素為自變量，用-1，0，1編碼每一個變量的低、中、高試驗水平（見表1），以總皂苷提取率（Y）為響應值，利用Box-Behnken方法設計響應面優(yōu)化試驗。

1.3.4 傳統(tǒng)水提和醇提工藝制備總皂苷提取液

根據(jù)文獻[19]中人參葉總皂苷的熱水浸提條件，即刺楸葉和水的料液比為1∶16（g∶mL）、在沸騰狀態(tài)下回流提取時間4.2 h，制得刺楸葉總皂苷的水提液。

按照酶法提取的最佳料液比、提取時間和乙醇體積分數(shù)在80℃條件下回流提取，制得刺楸葉總皂苷的醇提液。根據(jù)1.3.1節(jié)方法計算水提液和醇提液的總皂苷提取率。

1.3.5 抑制羥基自由基能力評價

將刺楸葉總皂苷的酶法提取液、水提液調整到相同濃度，并分別稀釋2倍、3倍和4倍，制得系列質量濃度溶液，以相同質量濃度的VC溶液為陽性對照，按照羥基自由基試劑盒的說明書配制相應的溶液，在波長550nm處測定空白管、測定管、標準管、對照管樣液的吸光度值。

每1 mL溶液在37℃條件下反應1 min，使反應體系中H2O2濃度降低1 mmol/L定義為一個抑制羥自由基能力單位，U/mL。

抑制羥自由基能力計算公式如下：

式中：H為抑制羥基自由基能力，U/mL；OD1為對照管吸光度值；OD2為測定管吸光度值；OD3為標準管吸光度值；OD4為空白管吸光度值；C為標準品濃度，8.824mmol/L；V為取樣量，本實驗中均為0.2 mL；N為樣本測試前的稀釋倍數(shù)，此實驗中均為1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對總皂苷提取率的影響

稱取5份3 g刺楸葉粉末，按料液比1∶15（g∶mL）分別加入體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，添加刺楸葉質量1%的纖維素酶，在60℃條件下酶解2 h，考察乙醇體積分數(shù)對總皂苷提取率的影響，結果見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對總皂苷提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total saponins

由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)＜70%時，總皂苷提取率隨著乙醇體積分數(shù)的增加而升高；乙醇體積分數(shù)為70%時，總皂苷提取率達到最高，為2.30%，繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)，總皂苷提取率開始降低。這可能是由于乙醇體積分數(shù)較低時，一些親水性物質（如多糖、果膠、蛋白質等水溶性雜質）會溶出，影響皂苷提取；當乙醇濃度較高時則有親脂性物質、色素等成分溶出，與皂苷類物質競爭，且乙醇體積分數(shù)太大時易形成較大滲透壓[20-21]，導致皂苷溶解性差，從而使刺楸葉總皂苷的提取率降低。因此乙醇體積分數(shù)對總皂苷影響明顯，宜選70%。

2.1.2 料液比對總皂苷提取率的影響

稱取5份3g刺楸葉粉末，按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）分別加入體積分數(shù)70%的乙醇溶液，添加刺楸葉質量1%的纖維素酶，在60℃條件下酶解2 h，考察料液比對總皂苷提取率的影響，結果見圖2。

圖2 料液比對總皂苷提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total saponins

由圖2可知，隨著料液比增大，總皂苷提取率迅速增加，料液比達到1∶20（g∶mL）時，提取率達到最大，為2.44%，繼續(xù)增加料液比，提取率趨于平穩(wěn)?？赡苁怯捎谠龃罅弦罕葧黾哟涕比~粉末與溶劑的接觸，加快了傳質，促進皂苷提取，繼續(xù)增大溶劑量，總皂苷提取率則無明顯變化。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，當料液比1∶15（g∶mL）和1∶20（g∶mL）時，所得提取率并無顯著差異（P=0.085＞0.05），考慮到工藝成本，宜選擇料液比為1∶15（g∶mL）。

2.1.3 纖維素酶添加量對總皂苷提取率的影響

稱取5份3 g刺楸葉粉末，按料液比1∶15（g∶mL）加入體積分數(shù)70%的乙醇溶液，分別添加刺楸葉質量0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%的纖維素酶，在60℃條件下酶解2 h，考察纖維素酶添加量對總皂苷提取率的影響，結果見圖3。

由圖3可知，隨著纖維素酶添加量的增加總皂苷提取率也逐漸升高，當酶量達到1.3%時，總皂苷提取率達到峰值，為2.44%，繼續(xù)增大酶量，總皂苷提取率則明顯下降。這是因為纖維素酶達到一定量時，酶分子過于飽和，且由于酶的粘附性，阻礙與底物的結合，導致水解變慢，總皂苷提取率降低[22]。因此，纖維素酶添加量對總皂苷影響明顯，選擇1.3%為宜。

圖3 纖維素酶添加量對總皂苷提取率的影響Fig.3 Effect of cellulase addition on the extraction rate of total saponins

2.1.4 酶解溫度對總皂苷提取率的影響

稱取5份3 g刺楸葉粉末，按料液比1∶15（g∶mL）加入體積分數(shù)70%的乙醇溶液，添加刺楸葉質量1%的纖維素酶，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃條件下酶解2 h，考察酶解溫度對總皂苷提取率的影響，結果見圖4。

圖4 酶解溫度對總皂苷提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of total saponins

纖維素酶最適溫度為50～70℃[23]。由圖4可知，隨著溫度升高，總皂苷提取率先升后降趨勢明顯，在60℃時總皂苷提取率最高，為2.52%，繼續(xù)增加酶解溫度，提取率明顯降低。因此，酶解溫度對總皂苷提取影響明顯，宜選60℃。

2.1.5 酶解時間對總皂苷提取率的影響

稱取5份3 g刺楸葉粉末，按料液比1∶15（g∶mL）加入體積分數(shù)70%的乙醇溶液，添加刺楸葉質量1%的纖維素酶，在60 ℃條件下分別酶解1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，考察酶解時間對總皂苷提取率的影響，結果見圖5。

由圖5可知，當酶解時間從1 h延長至2 h，總皂苷提取率迅速增加到最大，為2.31%，繼續(xù)延長酶解時間，總皂苷提取率變化較小，且差異不顯著（P＞0.05）。這可能是由于2 h時，刺楸葉的細胞壁已酶解充分，繼續(xù)增加酶解時間對總皂苷提取率無明顯影響。因此，酶解時間宜選2 h。

圖5 酶解時間對總皂苷提取率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of total saponins

2.2 響應面試驗結果

固定酶解時間、料液比分別為2 h和1∶15（g∶mL），以單因素試驗中對總皂苷影響明顯的酶解溫度（X1）、纖維素酶添加量（X2）和乙醇體積分數(shù)（X3）3個因素為自變量，皂苷提取率（Y）為因變量，設計Box-Behnken法響應面優(yōu)化試驗方案及結果如表2所示。采用Design Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，模型及方差分析結果見表3，所得二元回歸方程為：

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

根據(jù)表3方差分析結果，二元回歸擬合失擬項不顯著（P=0.356 6＞0.05），模型則極顯著（P＜0.000 1），表明預測模型對試驗數(shù)據(jù)的擬合程度高。校正擬合度0.984 9和預測擬合度0.940 1一致，模型信噪比為29.389＞4，變異系數(shù)為0.95%，表明回歸模型可信度高、相關性好，操作穩(wěn)定性良好，可用于預測。由表3中F（X1）=121.68＞F（X3）=73.92＞F（X2）=7.61可知，各因素對刺楸葉總皂苷提取率的影響為：酶解溫度＞乙醇體積分數(shù)＞纖維素酶添加量；同時，X1X3和X2X3對總皂苷提取率無顯著作用（P＞0.05），X2、X1X2對總皂苷提取率的作用顯著（P＜0.05），而X1、X3、X12、X22和X32對總皂苷提取率的作用極顯著（P＜0.000 1），說明酶解溫度、乙醇體積分數(shù)和纖維素酶添加量與總皂苷提取率間不是簡單的線性關系，盡管各因子間交互作用對總皂苷提取率影響較小，但其二次項影響則及其顯著。相關系數(shù)R2=0.993 4表明該回歸擬合模型能解釋99.34%的因變量變化，即只有約0.66%能影響總皂苷提取率的作用變量未納入該預測模型。因此，該二元回歸擬合方程能用于刺楸葉總皂苷提取工藝過程的預測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

二元回歸多項式的響應面結果見圖6，其中響應面和等高線形狀可直觀反映各因素的影響程度、交互作用及模型的極值情況。圖6中酶解溫度和乙醇體積分數(shù)、纖維素酶添加量和乙醇體積分數(shù)的等高線圖中心區(qū)域均成橢圓形，交互作用明顯；酶解溫度與纖維素酶添加量的等高線圖中心部分成圓形，交互作用不明顯。此外，乙醇體積分數(shù)、酶解溫度、纖維素酶添加量3個因素與總皂苷提取率的響應面均構成開口向下的凸面，表明在試驗點連續(xù)區(qū)域內存在最大值。用Design Expert 8.0.6軟件自動求解總皂苷最佳提取工藝為：酶解溫度71.27℃、乙醇體積分數(shù)72.88%、纖維素酶添加量1.11%，提取率理論預測值為2.53%。

圖6 乙醇體積分數(shù)、酶解溫度和纖維素酶添加量交互作用對總皂苷提取率影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ethanol concentration,hydrolysis temperature and cellulase addition on extraction rate of total saponins

2.3 響應面驗證試驗

為方便實際操作，將最佳工藝條件修正為：酶解溫度71℃、乙醇體積分數(shù)73%和纖維素酶添加量1.1%，其他提取條件為酶解時間2 h，料液比1∶15（g∶mL）。在此條件下，進行3次驗證試驗，實測總皂苷平均提取率為（2.52±0.06）%，與理論預測值2.53%吻合一致，表明擬合的二元多項式模型對刺楸葉中總皂苷的酶法提取工藝具有指導和預測作用。

本文利用傳統(tǒng)水提法、醇提法得到刺楸葉總皂苷提取率分別為（1.25±0.02）%和（1.65±0.09）%，只有酶法提取工藝的49.60%和65.48%，且其費時更長、提取溫度更高，因此酶法提取優(yōu)勢明顯，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2.4 羥自由基抑制能力評價

為比較酶法和水提法所得刺楸葉總皂苷的抗氧化活性，將兩種溶液調整總皂苷質量濃度為0.37 g/L，并分別稀釋2倍、3倍和4倍后制得0.19 g/L、0.13 g/L、0.09 g/L系列質量濃度的溶液，以相同質量濃度的VC標品液為陽性對照，測得羥基自由基抑制能力如圖7所示。

圖7 刺楸葉總皂苷和VC的羥自由基抑制能力比較Fig.7 Comparison of scavenging hydroxyl radical activities of VC and total saponins fromK.septemlobusleaves

羥自由基抑制能力是衡量抗氧化能力的重要指標。圖7中各質量濃度下，總皂苷水提液和酶提液的羥自由基抑制能力均明顯高于VC，其中水提液的羥自由基抑制能力均較強，酶提液和VC的羥自由基抑制能力均隨著質量濃度升高而明顯增強，到0.37 g/L時達到最高，此時水提液和酶提液的羥自由基抑制能力無顯著差異（P=0.103＞0.05），是VC標品液的1.79倍，表現(xiàn)出較強的羥自由基抑制能力。這是由于水提法有利于刺楸葉中苯丙烷類、酚酸以及多糖等水溶性抗氧化物質的析出，使得水提液在較低質量濃度0.09g/L時具有較強的羥自由基抑制能力，分別是酶提液和VC標品液的1.40倍和6.21倍；質量濃度增加至0.37 g/L時，總皂苷起主要作用，其他親水性抗氧化物質的影響較小，導致酶提液與水提液的羥自由基抑制能力一致。

3 結論

針對大別山野生刺楸資源，本研究建立了刺楸葉總皂苷的酶法提取工藝，并利用響應面法獲得最佳提取工藝條件為：酶解溫度71℃，纖維素酶添加量1.1%，乙醇體積分數(shù)73%，料液比1∶15（g∶mL），酶解時間2 h。該條件下刺楸葉總皂苷提取率為2.52%，是傳統(tǒng)醇提和水提工藝提取率的1.5倍和2倍，且費時更少、溫度更低，適合產(chǎn)業(yè)化加工；所得酶提液的羥自由基抑制能力是相同質量濃度VC的1.78～4.45倍，且在質量濃度0.37 g/L時與水提液的羥自由基抑制能力無顯著差異，具有較強的抗氧化活性，從而為大別山刺楸植物資源的綜合利用提供了試驗依據(jù)。

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