葛 謙，劉正庭，陳 翔，張鋒鋒，牛 艷，楊 靜，吳 燕*

（1.寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，寧夏 銀川 750002；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

顏色作為葡萄酒品質(zhì)評(píng)價(jià)最重要的指標(biāo)之一，蘊(yùn)含了葡萄酒的產(chǎn)地、品種、釀造工藝、陳釀時(shí)間酒齡，甚至葡萄酒缺陷等信息[1-4]?；ㄉ兆鳛槠咸丫浦饕噬镔|(zhì)，主要存在于紅色、紫色葡萄漿果皮中最靠近表皮3～4層細(xì)胞的液泡中[5-7]，使其呈現(xiàn)出紅色、磚紅色、紫紅色等不同顏色[8-10]。在自然界中，花色苷常以糖苷形式穩(wěn)定存在，主要有5種花色苷（anthocyanidin）形成的糖苷及其衍生物：花青素（cyanidin）、花翠素（delphindin）、甲基花青素（peonidin）、甲基花翠素（petunidin）和二甲花翠素（malvidin）[11-12]?；ㄉ站哂兄匾纳锘钚?，對(duì)人類具有許多生理保健功能，如消除自由基、抗炎、抗癌、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、美容以及減肥等，在藥品和化妝品方面都具有廣泛的應(yīng)用[13]。

葡萄酒釀造過(guò)程中顏色的變化始終是葡萄酒學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)，關(guān)系著葡萄酒釀造工藝的質(zhì)量控制、貯藏階段的顏色品質(zhì)的穩(wěn)定性以及葡萄酒風(fēng)格特色。HANFL等[14]采用主成分回歸（principalcomponentregression，PCR）分析方法得到結(jié)果：赤霞珠葡萄酒中參與分析的花色苷顏色占新鮮葡萄酒紅色色調(diào)的64.56%～81.57%。葡萄酒中花色苷主要以游離、結(jié)合以及聚合的狀態(tài)存在，其中游離態(tài)花色苷主要存在于新鮮葡萄酒中，儲(chǔ)存的前幾年便與其他物質(zhì)結(jié)合而消失，結(jié)合態(tài)及聚合態(tài)花色苷受酒齡影響較小[2，15-16]。在葡萄酒釀造過(guò)程中，發(fā)酵初期葡萄皮中部分單體花色苷通過(guò)浸漬作用進(jìn)入葡萄酒汁液中，顏色呈鮮紅色，隨著發(fā)酵作用的進(jìn)行，單體花色苷逐漸聚合為聚合花色苷使其呈磚紅色[17-21]。

花色苷的含量及組成在葡萄酒釀造和陳釀過(guò)程中變化極其復(fù)雜，目前對(duì)顏色的表述有葡萄酒顏色（wine color，WC）包括了已被氧化的不穩(wěn)定花色苷，總色素（totalcolorof pigments，WCA）包括了離子化的花色苷，聚合色素（polymericpigmentcolor，PPC）是花色苷和其他酚類物質(zhì)發(fā)生聚合反應(yīng)生成的色素，對(duì)葡萄酒起穩(wěn)定作用[22]。本研究以賀蘭山東麓赤霞珠葡萄酒為研究對(duì)象，分析了不同品種葡萄酒在釀造過(guò)程中花色苷6種主要組分的變化規(guī)律，并輔以色度、色調(diào)、感官評(píng)價(jià)WC、WCA、PPC等指標(biāo)，初步評(píng)價(jià)了葡萄酒釀造過(guò)程中變化規(guī)律及其相關(guān)性，為葡萄酒釀造工藝改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄：寧夏銀川永寧赤霞珠（CabernetSauvignon）。6種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Chromadex公司，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 花色苷標(biāo)準(zhǔn)樣品信息Table 1 Information of anthocyanins standard sample

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WLS21：保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品發(fā)酵工程與食品安全控制實(shí)驗(yàn)室。

甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國(guó)Merck公司；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）：上?；瘜W(xué)試劑有限公司；檸檬酸、果膠酶、偏重亞硫酸鉀、磷酸氫二鈉、三水醋酸鈉、氯化鉀（分析純）：北京為民生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀（配2475紫外檢測(cè)器及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）：美國(guó)Waters公司；凱航HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市凱航儀器有限公司；FRQ-1006單槽超聲波清洗機(jī)：杭州法蘭特超聲波科技有限公司；Mili-Q型超純水機(jī)：美國(guó)密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：釀酒葡萄原料取5 kg除梗破碎入罐（10 L棕色玻璃罐），添加果膠酶40mg/L，偏重亞硫酸鉀100mg/L，于13～15℃條件下浸漬3d后，添加釀酒酵母WLS21（200mg/L），于25～28℃條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵，當(dāng)總糖含量＜4 g/L時(shí)進(jìn)行皮渣分離，進(jìn)入蘋果酸乳酸發(fā)酵，溫度控制在（20±2）℃。蘋果酸乳酸發(fā)酵結(jié)束后，（4±2）℃低溫保藏。取樣品期間，做3個(gè)重復(fù)，每次將葡萄酒搖勻取20mL，進(jìn)行顏色指標(biāo)的監(jiān)測(cè)。

1.3.2 游離花色素苷采用示差法[23]

用移液管吸取2 mL樣品液，分別用pH1.0（0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67，V/V）和pH4.5（0.2 mol/L NaAc·3H2O∶0.2 mol/L HAc=1∶1，V/V）的緩沖液稀釋至20 mL，混勻。以2 mL蒸餾水加18 mL相應(yīng)緩沖液作空白，測(cè)定波長(zhǎng)510 nm處的吸光度值。

游離花色苷的含量（二甲花翠素葡萄糖苷）計(jì)按公式（1）、（2）計(jì)算：

式中：A為吸光度值；26 900為錦葵色素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)；449.12為二甲花翠素3-O-葡萄糖苷的物質(zhì)的量，g/mol。

1.3.3 葡萄酒色度、色調(diào)的測(cè)定[23]

將葡萄酒過(guò)4.5 μm濾膜，測(cè)定其pH。用相同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋10倍，于1 cm比色皿中，測(cè)定波長(zhǎng)420 nm、520 nm、620 nm處的吸光度值，三者之和的10倍為葡萄酒的色度。420 nm/520 nm為色調(diào)。

1.3.4 WC、WCA、PPC的測(cè)定[24]

WC的測(cè)定：將40 μL乙醛加入4 mL酒樣中，45 min后測(cè)定波長(zhǎng)520 nm處的吸光度值。

WCA的測(cè)定：將9 mL 0.1 mol/L鹽酸加入1 mL酒樣中，4～5 h后測(cè)定波長(zhǎng)520 nm處的吸光度值。

PPC的測(cè)定：將15 mg NaHSO3加入5 mL酒樣中，1 min后測(cè)定波長(zhǎng)520 nm處的吸光度值。

1.3.5 6種花色苷的測(cè)定[25]

前處理方法：稱取5.00 g葡萄酒于150 mL三角瓶中，加入無(wú)水乙醇∶鹽酸∶水（2∶1∶1，V/V）提取劑25 mL，搖勻，超聲30 min后，于100℃沸水浴冷凝回流1 h。取出樣品冷卻至室溫，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后待測(cè)。釀酒葡萄樣品稱取10.00 g，前處理方法同葡萄酒。

色譜條件為色譜柱：Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：525 nm；流動(dòng)相：A乙腈；B 0.1%磷酸水溶液；流速：0.8 mL/min，梯度洗脫；進(jìn)樣體積：5 μL，0～25 min，乙腈10%～25%；25～27 min，乙腈25%～10%；流速為0.8 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠葡萄酒釀造及貯藏階段6種花色苷組分及含量變化規(guī)律

在赤霞珠葡萄酒釀造和貯藏過(guò)程中，監(jiān)測(cè)葡萄酒中花色苷組分及含量變化規(guī)律，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在釀酒葡萄壓榨成葡萄汁入罐前，Pt未檢出，Dp、Cy、Pg、Pn、Mv分別占ACY的6.66%、10.79%、6.81%、16.99%、57.92%；在第26天酒精發(fā)酵階段結(jié)束，Dp、Cy、Pg、Pn、Mv分別占ACY的14.84%、14.77%、6.54%、6.57%、46.24%；在第36天蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段結(jié)束，Dp、Cy、Pg、Pn、Mv分別占ACY的17.26%、17.63%、7.98%、6.50%、56.41%。由此可知，花色苷各組分在總花色苷含量所占比例中，Mv占46.24%～57.92%，變化不明顯，是葡萄汁及葡萄酒主要花色苷組分；Dp、Cy、Pg呈上升趨勢(shì)，Pn呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明在葡萄酒釀造過(guò)程中花色苷不同組分存在著相互轉(zhuǎn)化關(guān)系[26]；與此同時(shí)，Cy、Pg、Pn、Mv、ACY在入罐前第1天含量最低，分別為1.41 mg/kg、0.89mg/kg、2.22mg/kg、7.57mg/kg、13.07mg/kg；Dp在第3天最低，為0.87 mg/kg；Dp、Cy、Pg、Pn、Mv、ACY分別在第28天（75.67mg/kg）、第28天（83.43 mg/kg）、第36天（30.89 mg/kg）、第36天（30.20 mg/kg）、第17天（218.81 mg/kg）、第28天（423.4 mg/kg）時(shí)含量達(dá)到最高。在貯藏階段（65～154 d），花色苷各組分呈波浪形遞減趨勢(shì)，說(shuō)明葡萄酒酒精發(fā)酵及蘋果酸乳酸發(fā)酵過(guò)程中有利于葡萄酒花色苷的富集，且在蘋果酸乳酸完成時(shí)各花色苷含量均達(dá)到最高，在貯藏階段略有下降，可能與貯藏條件（溫度、微氧等）有關(guān)，后續(xù)還需進(jìn)一步深入研究。PECHAMAT L等[27]認(rèn)為溫度、光、氧氣對(duì)葡萄酒的顏色影響很大。在葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中，酚類物質(zhì)的降解，是由于葡萄酒與空氣接觸所引起的酚類物質(zhì)的氧化造成的。

表2 赤霞珠葡萄酒釀造過(guò)程中花色苷變化規(guī)律(n=3)Table 2 Change rules of anthocyanins in the brewing process of Cabernet Sauvignon wine

2.2 赤霞珠葡萄酒釀造及貯藏階段顏色參數(shù)變化規(guī)律

表3 赤霞珠葡萄酒釀造過(guò)程中顏色參數(shù)變化規(guī)律(n=3)Table 3 Change rule of color parameters in the brewing process of Cabernet Sauvignon wine

在赤霞珠葡萄酒釀造和貯藏過(guò)程中，監(jiān)測(cè)葡萄酒中顏色參數(shù)變化規(guī)律，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，色度、色調(diào)、PPC、WCA、WC在第1天（葡萄汁）均最低，分別為2.78、0.43、0.18、0.35、1.20，在26 d、96 d、109 d、20 d、26 d時(shí)含量達(dá)到最高，分別為17.86、0.65、10.23、2.57、3.26。色度、色調(diào)、PPC、WCA、WC在葡萄酒釀造及貯藏過(guò)程中均程序先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明葡萄酒在釀造過(guò)程中對(duì)酒體的顏色有促進(jìn)作用，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，在貯藏階段程序小幅度的下降，這和日常對(duì)葡萄酒釀造及貯藏階段感官認(rèn)知方面的顏色變化相一致。色度[28]代表著對(duì)葡萄酒顏色深淺的感知，色調(diào)是對(duì)葡萄酒一系列各種各樣的顏色及不同的組合的感知。在整個(gè)釀造及貯藏階段，色度變化幅度較大（2.78～17.86），色調(diào)變化幅度較?。?.43～0.65），說(shuō)明在酚類物質(zhì)、酵母菌、pH等綜合因素的影響下，葡萄酒顏色由淺變深，而各顏色之間的變化不很明顯。聚合色素（PPC）是花色苷和其他酚類物質(zhì)發(fā)生聚合反應(yīng)生成的色素，對(duì)葡萄酒顏色起到穩(wěn)定性作用。在葡萄酒釀造及貯藏階段，葡萄酒PPC由0.18（第1天）呈波浪形遞增趨勢(shì)，在第17d、20d達(dá)到10.00，在第109天達(dá)到最高值10.23，在第109～154 d穩(wěn)定在9.35～10.23，說(shuō)明葡萄酒釀造過(guò)程中花色苷由單體花色苷慢慢形成聚合花色苷，在貯藏階段達(dá)到穩(wěn)定且保持著較高的聚合度，這對(duì)葡萄酒貯藏階段的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。這與韓富亮等人研究結(jié)果相一致：葡萄酒中花色苷主要以游離、結(jié)合以及聚合的狀態(tài)存在，其中游離態(tài)花色苷主要存在于新鮮葡萄酒中，儲(chǔ)存的前幾年便與其他物質(zhì)結(jié)合而消失，結(jié)合態(tài)及聚合態(tài)花色苷受酒齡影響較小[2，18，22]。葡萄酒顏色（WC）包括了易被氧化的不穩(wěn)定的花色苷，總色素（WCA）包括了離子化的花色苷，在整個(gè)釀造及貯藏階段呈波浪形先上升后下降的趨勢(shì)，變化幅度較小，分別為1.20～3.26、0.35～2.57，這和葡萄酒色度、色調(diào)以及花色苷主要組分變化規(guī)律相一致。有研究表明，花色苷在葡萄酒的釀造過(guò)程和貯藏過(guò)程中不斷變化，葡萄酒的顏色也相應(yīng)地發(fā)生變化，隨著基本花色苷和?；ㄉ盏臏p少，吡喃花色苷和聚合花色苷的增多，葡萄酒的顏色由鮮艷的紅色逐漸變?yōu)殛愥劸频拇u紅色等顏色[2，4，22，28]。

2.3 赤霞珠葡萄酒釀造及貯藏階段各顏色參數(shù)之間的相關(guān)性分析

表4 赤霞珠葡萄酒釀造及貯藏階各顏色參數(shù)之間的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of color parameters in the Cabernet Sauvignon wine during brewing and storage stages

對(duì)赤霞珠葡萄酒釀造過(guò)程中花色苷各組分及顏色參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，赤霞珠葡萄酒釀造和貯藏階段顏色參數(shù)之間表現(xiàn)出了很好的相關(guān)性，Dp、Cy、Pg、Pn、Mv、ACY、色度、WCA、WC之間均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與色調(diào)不相關(guān)，PPC與色調(diào)和葡萄酒顏色呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了赤霞珠紅葡萄酒釀造和貯過(guò)程中，葡萄酒中花色苷各組分及顏色參數(shù)變化規(guī)律及相關(guān)性，結(jié)果表明，在葡萄酒釀制和貯藏階段，不同品種葡萄酒花色苷各組分均呈現(xiàn)先上升，在蘋果酸乳酸發(fā)酵階段結(jié)束前達(dá)到最高而后開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，在貯藏階段后期趨于穩(wěn)定。Dp、Cy、Pg、Pn、Mv、ACY、色度、WCA、WC之間均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與色調(diào)不相關(guān)。PPC與色調(diào)和WC呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Dp、Cy占ACY的比例均呈波浪形遞增趨勢(shì)，Pt、Pg、Mv占ACY的比例變化不明顯，維持動(dòng)態(tài)穩(wěn)定的趨勢(shì)，Pn占ACY的比例均呈波浪形遞減趨勢(shì)。葡萄酒酒精發(fā)酵及蘋果酸乳酸發(fā)酵有利于葡萄酒花色苷的富集，且在蘋果酸乳酸完成時(shí)各花色苷含量均達(dá)到最高，在貯藏階段略有下降，可能與貯藏條件（溫度、微氧等）有關(guān)，后續(xù)還需進(jìn)一步深入研究。本試驗(yàn)在前人的基礎(chǔ)上研究了赤霞珠釀酒葡萄釀造過(guò)程和貯藏過(guò)程花色苷組分及含量變化規(guī)律的研究，這為葡萄酒釀造工藝的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)，為葡萄酒顏色穩(wěn)定性及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

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