于 博，李云捷，余海忠，湯尚文，吳進(jìn)菊

（湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北 襄陽 441053）

生姜是衛(wèi)生部首批公布的藥食兼用植物資源，其在食品、藥品、化妝品及農(nóng)業(yè)殺害劑等領(lǐng)域有著廣泛地應(yīng)用。生姜中含有數(shù)十種具有生物活性的化學(xué)成分，主要包括酚類化合物、黃酮化合物以及揮發(fā)性的醛烯類[1]。姜酚是生姜中的多酚類物質(zhì)，其具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗炎、強(qiáng)心、降壓、降血脂、降血糖、抗凝血等多種生物活性[2]。愈創(chuàng)木酚和β-羥基酮結(jié)構(gòu)是姜酚生物活性的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，苯環(huán)上連接的烴鏈長度對姜酚的生物活性具有較大影響。根據(jù)烴鏈長度，姜酚可分為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和12-姜酚等。在抗氧化能力上，3種常見的姜酚對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧自由基和羥基自由基的清除能力的順序是10-姜酚＞8-姜酚＞6-姜酚[3]；在抗炎中對活性氧的抑制能力上10-姜酚＞8-姜酚＞6-姜酚[4]。研究還發(fā)現(xiàn)生姜的抗神經(jīng)炎癥能力主要取決于10-姜酚，而不是6-姜酚，這主要是由于烷基鏈長度的增加，姜酚的抗神經(jīng)炎癥能力不斷增加[5]。10-姜酚還具有通過抑制?；L素的降解來改善厭食癥的作用[6]。10-姜酚的研究目前還主要集中在分離純化[7-9]和生物活性[10]的探索上，對姜酚生物活性的保護(hù)策略研究較少。但10-姜酚中存在的愈創(chuàng)木酚結(jié)構(gòu)和β-羥基酮結(jié)構(gòu)使得其具有非?；顫姷睦砘再|(zhì)，水溶性、熱穩(wěn)定較差，且易被降解和氧化，這極大地限制了其應(yīng)用范圍。目前提高姜酚穩(wěn)定性的方法主要包括結(jié)構(gòu)修飾方法和分子微膠囊法。本研究采用6-O-α-D-麥芽糖基-β-環(huán)糊精（6-O-α-maltosylβ-cyclodextrin，Mal-β-CD）包合10-姜酚的方法來穩(wěn)定10-姜酚的生物活性有效態(tài)勢。

分子微膠囊技術(shù)是通過分子間的相互作用，將客體分子全部或部分包埋到主體分子中，屏蔽外部不利環(huán)境因素，有效地或選擇性地保護(hù)客體分子的特征官能團(tuán)或活性中心。環(huán)糊精及其衍生物是分子微膠囊領(lǐng)域應(yīng)用較多的一類主體分子，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有疏水性空腔結(jié)構(gòu)[11]，能夠識別各類具有不同結(jié)構(gòu)特征的非極性客體[12-15]，從而形成主客體復(fù)合物。6-O-α-D-麥芽糖基-β-環(huán)糊精（Mal-β-CD）是在母體環(huán)糊精上通過糖苷鍵連接麥芽糖基團(tuán)形成的具有良好水溶性和安全性的主體分子，其包合能力與母體環(huán)糊精類似[16]。本研究采用溶劑法制備10-姜酚/Mal-β-CD包合物，借助紫外光譜、紅外光譜、X-射線衍射技術(shù)、熱重及差示掃描量熱聯(lián)用分析等技術(shù)研究包合物結(jié)構(gòu)特征，并采用分子模擬對接技術(shù)構(gòu)建10-姜酚/Mal-β-CD包合物的超分子結(jié)構(gòu)，以期擴(kuò)大10-姜酚在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10-姜酚（純度98%）：成都德斯特生物技術(shù)有限公司；6-O-α-D-麥芽糖基-β-環(huán)糊精（純度98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；D8 Advance X射線衍射儀：布魯克AXS有限公司；SDTQ600同步熱分析儀：美國TA公司；UV-2600PC紫外/可見光分光光度計(jì)、IRPrestige-21傅立葉紅外變換光譜儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；QYC系列全溫培養(yǎng)搖床：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DW-86L626超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；PGJ-10-AS（超）純水機(jī)：武漢品冠儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 10-姜酚/Mal-β-CD包合物及物理混合物的制備

稱取1.459 g Mal-β-CD（1 mmol），用30 mL超純水溶解，置于棕色瓶中，加入0.350 g 10-姜酚（1 mmol），在25 ℃恒溫振蕩器中，振蕩反應(yīng)72 h。離心后取上清液過0.45 μm膜，冷凍干燥制得10-姜酚/Mal-β-CD包合物。分別稱取Mal-β-CD 1.459 g和10-姜酚0.070 0 g，混合均勻即為10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物。

1.3.2 紫外光譜分析

分別稱取10mg的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物，分別溶于體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液中，以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液為空白對照，進(jìn)行紫外全波長掃描。

1.3.3 傅里葉紅外光譜分析

分別取3 mg的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物，分別加入150mg溴化鉀，壓片后置于傅里葉紅外光譜分析儀中，測定波數(shù)范圍為4000～400cm-1，分辨率為0.01cm-1，掃描次數(shù)為32次，室溫下進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.4 X-射線衍射分析

分別取10mg的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物，進(jìn)行X-射線衍射。分析條件：室溫，Cu靶（Kα射線，波長=1.541 87 ?），掃描電壓40 kV，管電流40 mA，掃描速率2°/min，采樣間隔0.02°，掃描范圍為10～80 °。

1.3.5 熱重及差示掃描量熱同步分析

將5 mg左右的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物進(jìn)行同步熱分析，記錄其熱分析圖譜。測定條件為：在純氮?dú)猸h(huán)境下進(jìn)行掃描分析，掃描溫度范圍為40～600℃，掃描速率為10℃/min。

1.3.6 分子對接

在ChemDraw12.0軟件中構(gòu)造10-姜酚，采用ChemDraw 3D 12.0軟件中的MM2 Minimize功能模塊對上述所有分子進(jìn)行能量優(yōu)化。Mal-β-CD分子的PDB文件來源于Pubmed數(shù)據(jù)庫中[17]。運(yùn)用AutoDock分子模擬軟件，借助Vina模塊將對接參數(shù)設(shè)置為對接中心，坐標(biāo)為主體分子的中心對稱點(diǎn)，對接盒子大小為20 ?×20 ?×30 ?，搜索步長為0.375 ?，計(jì)算構(gòu)象數(shù)為10個，能差范圍為10 kcal/mol，采用遺傳學(xué)算法，其他參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外吸收光譜

在主客體超分子化學(xué)的研究中，通過比較超分子體系形成前后紫外光譜的變化，可以判斷超分子形成過程中是否形成新的化學(xué)鍵，客體分子是否全部或部分進(jìn)入到主體分子之中。10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚與Mal-β-CD包合物及混合物的紫外圖譜如圖1所示。由圖1可知，Mal-β-CD在紫外范圍內(nèi)并無特征吸收峰，這主要是因?yàn)镸al-β-CD沒有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)；10-姜酚、10-姜酚與Mal-β-CD包合物及二者的物理混合物在紫外區(qū)均有吸收，這主要是由于10-姜酚具有苯環(huán)和β-羥基酮不飽和結(jié)構(gòu)，而且三者的譜圖峰位、峰形基本一致，這說明在包合物形成的過程中，并沒有形成新的不飽和結(jié)構(gòu)，10-姜酚與Mal-β-CD的相互作用可能是以非共價鍵的次級作用力為主導(dǎo)；根據(jù)二者分子結(jié)構(gòu)特征，初步推斷Mal-β-CD的疏水性空腔與10-姜酚的非極性基團(tuán)發(fā)生了疏水相互作用。

圖1 10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚與Mal-β-CD包合物及10-姜酚與Mal-β-CD混合物的紫外圖譜Fig.1 UV spectrum of 10-gingerol,Mal-β-CD,10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex and 10-gingerol and Mal-β-CD mixture

2.2 紅外光譜

紅外光譜經(jīng)常被用來研究包合物是否形成，通過對比主體、客體、二者物理混合物及其包合物的紅外光譜圖，通過特征吸收峰位置和強(qiáng)度的變化，來推斷主客體間是否發(fā)生包合作用。圖2為10-姜酚、Mal-β-CD、Mal-β-CD/10-姜酚包合物及其混合物的紅外光譜圖。由圖2可知，10-姜酚在3 526 cm-1處具有O-H的伸縮振動峰，在波數(shù)1 649 cm-1處具有C=O的特征吸收峰，在1520cm-1、1609cm-1、1460cm-1、1 439 cm-1處具有苯環(huán)的特征吸收峰；Mal-β-CD的紅外光譜具有羥基的伸縮振動峰（3 412 cm-1）、亞甲基的振動峰（2 928 cm-1）、糖苷鍵的伸縮振動峰（1 028 cm-1）。10-姜酚與Mal-β-CD物理混合物的特征吸收峰為二者紅外光譜的疊加，這表明混合物中二者之間沒有相互作用。10-姜酚與Mal-β-CD包合物的特征吸收峰與二者的物理混合物、10-姜酚的紅外光譜明顯不同，而與Mal-β-CD的紅外圖譜類似，在波數(shù)400～1700cm-1，10-姜酚的特征吸收峰減少明顯，尤其是苯環(huán)的特征吸收峰基本被母體Mal-β-CD的紅外光譜所掩蓋，這說明二者發(fā)生了相互作用，形成了新的物相；和其他三個紅外光譜相比較，包合物的圖譜沒有出現(xiàn)新的紅外吸收峰，這說明在10-姜酚與Mal-β-CD的包合過程中沒有形成新的共價鍵，主客體分子各自保留其原有的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，包合物的形成不會影響到客體分子的生物功能特性。

圖2 10-姜酚（1）、Mal-β-CD（2）、10-姜酚與Mal-β-CD包合物（3）、10-姜酚與Mal-β-CD混合物（4）的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrogram of 10-gingerol(1),Mal-β-CD(2),10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex(3)and 10-gingerol and Mal-β-CD(4)mixture

2.3 X-射線衍射分析

X-射線衍射法在超分子化學(xué)的研究中具有廣泛用途，其可以判斷生成主客體固體包合物是否形成以及驗(yàn)證包合物的純度。利用主客體晶體X射線衍射的不同，并對二者的物理混合物與包合物進(jìn)行晶型解析，可以確證主客體分子間的包合作用。圖3為10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚與Mal-β-CD包合物及混合物的X衍射圖譜。由圖3可知，10-姜酚在2θ=12.888°、17.139°、17.819°、19.699°、20.806°、22.294°、25.066 °、25.423 °等處有尖銳的衍射峰，Mal-β-CD在2θ為10～15°和15～25°處有兩處寬衍射峰，二者物理混合物的衍射峰大致為10-姜酚和Mal-β-CD衍射峰的疊加，由此可知，10-姜酚與Mal-β-CD直接混合后，其晶體類型均沒有發(fā)生變化；包合物在2θ為10～15°和15～25°處的衍射峰與Mal-β-CD類似，客體分子10-姜酚的特征衍射峰在包合物中消失，晶體類型明顯發(fā)生變化，這說明包合物中的10-姜酚分子的微環(huán)境發(fā)生了重大變化，這主要是由于10-姜酚的非極性基團(tuán)與環(huán)糊精空腔通過疏水相互作用形成了新的物相，而致使包合物呈現(xiàn)出主體的無定形狀態(tài)。

圖3 10-姜酚（1）、Mal-β-CD（2）、10-姜酚與Mal-β-CD包合物（3）、10-姜酚與Mal-β-CD混合物（4）的X-射線衍射圖Fig.3 X-ray diffraction pattern of 10-gingerol(1),Mal-β-CD(2),10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex(3)and 10-gingerol and Mal-β-CD(4)mixture

2.4 熱重及差示掃描量熱聯(lián)用分析

熱重/差示掃描量熱聯(lián)用可同時分析物質(zhì)在升溫過程中的重量變化和熱量變化，通過重量與熱量間的關(guān)系，分析物質(zhì)的熱穩(wěn)定性、脫水過程以及熔融過程。熱重/差示掃描量熱聯(lián)用技術(shù)廣泛地應(yīng)用于環(huán)糊精及其衍生物的包合物表征，能夠精確地測量包合物熱性質(zhì)，判斷包合物形成與否。重量變化是包合物形成的有力證據(jù)，通過對比10-姜酚、Mal-β-CD、二者包合物的同步熱分析圖譜，能夠表征10-姜酚與Mal-β-CD的包合作用以及包合物形成后對10-姜酚的穩(wěn)定性影響。10-姜酚、Mal-β-CD、二者包合物的熱重（thermal gravity，TG）及差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）曲線如圖4所示，由圖4中Mal-β-CD的TG曲線可知，Mal-β-CD在溫度低于275℃時，重量基本沒有損失，說明其水分和揮發(fā)類組分很少；在270～450℃的升溫范圍內(nèi)，失重明顯，這主要是其發(fā)生熱分解分子中的碳分解物逐步揮發(fā)所致；在450℃后重量趨于穩(wěn)定，說明其此時已分解完全。由Mal-β-CD的DSC曲線可知，在280～350℃之間有一個顯著的吸熱峰，峰值溫度為約313℃，這是由于其吸熱分解引起。10-姜酚在165～330℃范圍內(nèi)，重量快速損失，重量損失約91%，其DSC曲線表明該范圍內(nèi)，10-姜酚吸熱分解，峰值溫度約為255℃，溫度升至385℃左右時，重量趨于平衡。10-姜酚/Mal-β-CD包合物的TG曲線顯示，在280～380℃范圍內(nèi)重量下降明顯，而在160～260℃范圍內(nèi)，包合物重量沒有明顯降低，包合物的熱重曲線與母體Mal-β-CD的熱重曲線近似一致，10-姜酚的特征吸熱峰消失，表明其不再以晶態(tài)形式存在，而是完全分散在母體Mal-β-CD中，熱流數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)溫度達(dá)到300℃時，包合物才熔融并大量分解，這表明通過與Mal-β-CD的包合，10-姜酚的熱穩(wěn)定性得到了顯著提高。

圖4 10-姜酚（1）、Mal-β-CD（2）、10-姜酚與Mal-β-CD包合物（3）的熱重及差示掃描量熱圖Fig.4 TG/DSC curve of 10-gingerol(1),Mal-β-CD(2),10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex(3)

2.5 分子對接分析

圖5 10-姜酚與Mal-β-CD包合物三維超分子結(jié)構(gòu)Fig.5 Three-dimensional supermolecular structure of 10-gingerol-Mal-β-CD inclusion complex

分子對接試驗(yàn)常用于預(yù)測主客體分子形成超分子復(fù)合物時的取向和相互作用機(jī)制，通過幾何和能量匹配，環(huán)糊精的疏水性空腔與非極性基團(tuán)完成相互識別。通過使用Autodock方法對包合物的三維超分子結(jié)構(gòu)模擬，能夠推斷了包合方式，是研究超分子化合物的有效技術(shù)[18]。圖5是10-姜酚與Mal-β-CD通過分子模擬建立的超分子模型。由圖5可知，由于疏水相互作用，Mal-β-CD將10-姜酚的苯環(huán)和非極性側(cè)鏈包埋到疏水空腔中，同時發(fā)現(xiàn)10-姜酚與Mal-β-CD超分子復(fù)合物中形成了4個氫鍵，氫鍵鍵長分別為2.5 ?、2.0 ?、2.4 ?、2.5 ?；10-姜酚與 Mal-β-CD包合物的化學(xué)計(jì)量為1∶1，結(jié)合能為-19.32kJ/mol。分子對接試驗(yàn)表明，Mal-β-CD通過包合10-姜酚，能夠有效地保護(hù)其活性結(jié)構(gòu)，這將有助于提高10-姜酚的抗熱性和水溶性，這與同步熱分析的試驗(yàn)結(jié)論相一致。

3 結(jié)論

10-姜酚是生姜中天然存在的酚類化合物，其具有良好的生物活性，在功能性食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究采用溶劑法聯(lián)合冷凍干燥技術(shù)制備了10-姜酚/Mal-β-CD的包合物，通過紫外光譜、紅外光譜、X-射線衍射、熱重及差示掃描量熱聯(lián)用技術(shù)表征了復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征，證實(shí)Mal-β-CD對10-姜酚具有良好的包合能力。結(jié)合分子對接分析，10-姜酚的苯環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)入到環(huán)糊精的疏水性空腔中，維持復(fù)合物穩(wěn)定的作用力包括疏水相互作用和氫鍵；二者之間沒有形成新的化學(xué)鍵，10-姜酚以無定形狀態(tài)存在于包合物中，其熱穩(wěn)定性得到了明顯提高。因此，以麥芽糖基-β-環(huán)糊精為分子膠囊的壁材，通過10-姜酚的微膠囊化，有助于拓展10-姜酚在功能性食品、藥品及化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

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