鄭 苗，何 佳*，呂丹丹，宋文華，張雪雯

（河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院 洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心 河南科技大學(xué)微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，河南 洛陽 471023）

懷山藥（Dioscorea opposita）是產(chǎn)自于河南焦作地區(qū)的道地的名貴中藥材，藥食同源[1]，口感極佳，曾于2006年獲國家質(zhì)檢總局批準實施地理標志產(chǎn)品保護[2]。懷山藥又被稱為薯蕷、懷參、山芋等，位居“四大懷藥”之首，被國外譽為“中國人參”[3]。懷山藥中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、維生素、淀粉酶等[4]，以及膽堿、尿囊素、糖蛋白、皂苷、植酸、多巴胺、粗纖維、山藥素、甘露聚糖等活性成分，具有預(yù)防心腦血管疾病[5-6]，提高機體免疫力[7-8]，調(diào)節(jié)腸道功能、助消化，健脾補肺[9]，降血糖降血脂[10]，抗衰老抗腫瘤[11-12]等功能。乳酸菌具有腸道黏附率高，定植能力強，調(diào)節(jié)腸道菌群，降低膽固醇，緩解乳糖不耐癥以及分泌抗生素類物質(zhì)（細菌素），提高機體免疫力和抗癌等益生作用[13-14]。

當前，乳酸菌發(fā)酵食品已成為熱點[15-20]，薯類乳酸菌發(fā)酵也進入了人們的研究視野[21-25]，但以純山藥為原料，多種益生乳酸菌復(fù)合發(fā)酵尚未見報道，本試驗在前期試驗的基礎(chǔ)上，以四株乳酸菌為復(fù)合乳酸菌，對純懷山藥酶解液的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化并對其產(chǎn)物的抗氧化活性進行了研究，以期為懷山藥資源的深加工和綜合利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

懷山藥：河南大張實業(yè)有限公司；高溫α-淀粉酶（食品級、40 000 U/g）、果膠酶（食品級、20 000 U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；糖化酶（食品級、100 000 U/g）：上海藍季生物有限公司；檸檬酸（食品級）：河南興源化工產(chǎn)品有限公司；復(fù)合乳酸菌[植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（HZLp-005）∶干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）（HZLc-017）∶鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）（HZLr-023）∶嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）（HZLa-008）=0.619%∶0.670%∶0.835%∶0.876%]：本實驗室保藏；VC（分析純）：江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司；無水CaCl2、NaOH、FeSO4、H2O2、水楊酸、鄰苯三酚、無水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、K3[Fe（CN）6]、FeCl3（均為分析純）：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；Tris-HCl（分析純）：南京奧多福尼生物科技有限公司；濃鹽酸（分析純）：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基（色譜純）：上海藍季生物有限公司；三氯乙酸（分析純）：上海山浦化工有限公司；MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S4型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-25 pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；101-2ES電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250生化培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 懷山藥酶解液制備

鮮懷山藥→清洗→80℃漂燙10 min→去皮→切片（3～5 mm厚）→護色（0.3%抗壞血酸、0.4%檸檬酸、0.7%氯化鈣）→去離子水沖洗兩遍→加入5倍質(zhì)量的去離子水打漿→調(diào)pH至6.5，加入占原料質(zhì)量分數(shù)為0.08%的高溫α-淀粉酶，85℃酶解1h→降溫至55℃，加入原料質(zhì)量分數(shù)0.16%的果膠酶和0.09%的糖化酶，酶解3 h（酶解液中還原糖量為5.8%）→115℃滅菌20 min。

1.3.2 菌種活化

分別從斜面上刮取2環(huán)復(fù)合乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)18～24 h，以一定的接種量接種到懷山藥酶解液中，傳代2～3次，至活菌數(shù)達到1×108以上。

1.3.3 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵懷山藥工藝條件優(yōu)化

（1）單因素試驗

分別考察發(fā)酵時間（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h）、發(fā)酵溫度（29℃、33℃、37℃、41℃、45℃）、復(fù)合乳酸菌接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對乳酸產(chǎn)量的影響，每個處理重復(fù)3次，確定復(fù)合乳酸菌發(fā)酵懷山藥的最佳條件范圍。

（2）響應(yīng)面試驗

表1 懷山藥發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of Chinese yam

依據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，利用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合乳酸菌發(fā)酵懷山藥的工藝條件。在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）和接種量（C）為變量，以發(fā)酵液中的乳酸含量（Y）為響應(yīng)值優(yōu)化復(fù)合乳酸菌發(fā)酵懷山藥的工藝條件。響應(yīng)面試驗因素水平編碼見表1。

1.3.4 抗氧化活性比較

按照參考文獻[27-30]的方法，以0.05 g/L維生素C（vitamin C，VC）為對照，考察懷山藥酶解液發(fā)酵前、后的抗氧化活性。

1.3.5 測定方法

乳酸含量：GB 5413.34—2010《乳和乳制品中酸度的測定》方法[26]。

羥基自由基清除率測定：水楊酸法[27]；超氧自由基清除率測定：按照參考文獻[28]的方法進行；DPPH自由基清除率測定：按照參考文獻[29]的方法進行；還原力測定：按照參考文獻[30]的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合乳酸菌的單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對乳酸含量的影響

圖1 發(fā)酵時間對乳酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on lactic acid content

由圖1可知，發(fā)酵液中的乳酸含量隨時間的延長而增加，發(fā)酵32 h時乳酸含量達到最大值，為1.53%，延長發(fā)酵時間，乳酸含量趨于平穩(wěn)。這是由于開始時發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)豐富，乳酸菌大量繁殖，不斷消耗營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生大量的乳酸，產(chǎn)酸量達到最大值后，過酸的條件不利于益生菌的生長，產(chǎn)酸受到抑制，因此，32 h之后產(chǎn)酸量趨于平穩(wěn)。因而，選取最佳的發(fā)酵時間范圍為16～32 h。

2.1.2 發(fā)酵溫度對乳酸含量的影響

由圖2可知，發(fā)酵液中的乳酸含量隨溫度的升高呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢，在發(fā)酵溫度37℃時發(fā)酵液中的乳酸含量達到最大值，為1.26%。這是因為溫度較低時，乳酸菌的酶系在溫度較低時活性受到抑制，因而生長受到限制，進而導(dǎo)致產(chǎn)酸量較低，乳酸菌能夠生長的溫度范圍為25～45℃，最適生長溫度為37℃，當溫度升至37℃時，乳酸菌的生長最快，因而產(chǎn)酸量最大。因此，選取最佳的發(fā)酵溫度范圍為33～41℃。

圖2 發(fā)酵溫度對乳酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on lactic acid content

2.1.3 接種量對乳酸含量的影響

圖3 接種量對乳酸含量的影響Fig.3 Effect of inoculum on lactic acid content

由圖3可知，發(fā)酵液中的乳酸含量隨接種量的增加而呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢。在接種量為5%時，乳酸含量達到最大值，為1.625%。在接種量為1%～3%范圍內(nèi)，益生乳酸菌的群體生長速度最快。這是因為剛開始發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)豐富，接種量越大，乳酸菌迅速利用營養(yǎng)物質(zhì)進行發(fā)酵。但是，接種量＞3%后，由于乳酸菌種間存在競爭營養(yǎng)物質(zhì)用于自身繁殖的現(xiàn)象，一部分菌體在競爭中處于劣勢而死亡，因而乳酸含量會趨于平穩(wěn)。因而，選取最佳的接種量范圍為2%～4%。

2.2 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵懷山藥工藝條件優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

以發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）為評價因素，乳酸含量（Y）為評價指標進行響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2。

用Design Expert 8.05軟件對表2的試驗結(jié)果進行分析，得到3個影響因素與乳酸含量之間的二次回歸方程：

對該模型進行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表2 懷山藥發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of Chinese yam

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，乳酸菌發(fā)酵懷山藥工藝的二次模型的F值為82.43，P值＜0.000 1，說明該模型極顯著，失擬項的P=0.057 1＞0.05，不顯著，說明該模型的擬合度較好。同時，本研究的確定系數(shù)R2=0.9907，說明發(fā)酵液中乳酸含量結(jié)果與該模型的回歸值有很好的一致性，校正系數(shù)R2Adj=0.9786＞0.9，說明試驗結(jié)果中有97.86%受到所選因素的影響，只有2.14%不受影響。因此，該模型可以用來預(yù)測和分析乳酸菌發(fā)酵懷山藥過程中乳酸含量。在回歸方程各項方差分析結(jié)果表明，各因素對乳酸含量的影響主次為發(fā)酵時間（A）＞接種量（C）＞發(fā)酵溫度（B），交互項AB對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），交互項BC與AC對響應(yīng)值影響不顯著（P＞0.05），二次項A2、B2、C2對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析

利用Design Expert 8.05軟件對表3中的結(jié)果進行二次回歸擬合得出的響應(yīng)曲面和等高線如圖4所示。由圖4可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中的乳酸含量先上升后平穩(wěn)，隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸產(chǎn)量先升高后下降，從等高線圖可以清晰地看出，發(fā)酵溫度所對應(yīng)的等高線更陡，說明相對于發(fā)酵時間來說，發(fā)酵溫度的影響更為顯著；隨接種量的增加，乳酸產(chǎn)量先上升后趨于平穩(wěn)，接種量所對應(yīng)的等高線更陡，說明相對于發(fā)酵時間來說，接種量的影響更為顯著；隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸含量先上升后下降，隨著發(fā)酵溫度的升高，乳酸含量先上升后平穩(wěn)，從等高線上可以看出，接種量對應(yīng)的等高線更陡，說明相對于發(fā)酵溫度來說，接種量的影響更為顯著。

圖4 發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度及接種量交互作用對乳酸含量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,temperature and inoculum on lactic acid content

2.2.3 驗證試驗

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計所得結(jié)果和二次多項式方程，利用Design-Expert8.05軟件計算出最佳發(fā)酵工藝條件，乳酸菌發(fā)酵懷山藥的最佳工藝條件為：發(fā)酵時間22.83 h、發(fā)酵溫度37.64℃、接種量2.8%，在此條件下發(fā)酵液中的乳酸含量為1.437%。為了便于操作，將以上條件參數(shù)修正為發(fā)酵時間23 h、發(fā)酵溫度38℃、接種量3%。根據(jù)修正的工藝條件，經(jīng)過5次驗證試驗，發(fā)酵液中的乳酸含量可達到1.42%，與理論值相比，降低了0.017%，可見該模型較好的預(yù)測了試驗結(jié)果。

2.3 抗氧化活性

圖5 懷山藥發(fā)酵前后與VC的抗氧化性比較Fig.5 Comparison of antioxidant activity of VC and Chinese yam before and after fermentation

由圖5可知，懷山藥發(fā)酵前后的羥基自由基清除率分別為99.55%和99.95%，而VC為54.28%，說明懷山藥酶解液及酶解發(fā)酵液具有較高的清除羥基自由基的能力；懷山藥在發(fā)酵前對超氧自由基的清除率較低，為15.76%，而經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后的懷山藥對超氧自由基的清除率達94.45%，為發(fā)酵前的6倍，且高于VC；懷山藥發(fā)酵前后對DPPH自由基的清除率分別為73.85%和89.65%，均高于VC（51.39%）；發(fā)酵前懷山藥的還原能力與0.05 g/L VC的還原能力相近，發(fā)酵后的懷山藥還原能力提高了0.085，高于VC。

3結(jié)論

本試驗通過單因素及響應(yīng)面試驗優(yōu)化了復(fù)合乳酸菌發(fā)酵懷山藥的工藝條件。最終確定最佳的發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時間23 h、發(fā)酵溫度38℃、接種量為3%，在此條件下發(fā)酵液中的乳酸含量可達到1.42%。

懷山藥酶解發(fā)酵液對羥基自由基、超氧自由基、DPPH自由基清除率分別為99.95%、94.45%、89.65%，較發(fā)酵前均有不同程度的提高；還原力提高了0.085。

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