陳 辰，朱潤琪，劉 麗，馬 軒，葉曉婉，楊增光，席 宇，朱大恒*

（1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.華中科技大學(xué) 藥學(xué)院，湖北武漢 430074；3.北京諾禾致源科技股份有限公司，北京 301700）

作為一種重要的化工原料，L-乳酸在食品、紡織、化工、釀造、醫(yī)藥等行業(yè)的應(yīng)用十分廣泛[1-4]。由乳酸單體聚合而成的聚L-乳酸[5-7]可作為一種可用于制造綠色無污染的可降解塑料等材料，具有良好的應(yīng)用潛力和社會效益。目前L-乳酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和發(fā)酵法，鑒于化學(xué)法對環(huán)境造成的污染較大，目前已逐漸被環(huán)保、高效、清潔的微生物發(fā)酵法所代替[8]，發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的微生物主要有乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）和根霉菌屬（Rhizopussp.）[9-11]，其中LAB是目前L-乳酸發(fā)酵的主要微生物類群。副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）是近年來引起關(guān)注的一類乳酸菌，劉云[12]用副干酪乳桿菌HD1.7在MRS培養(yǎng)基上發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸，產(chǎn)量達(dá)到90 g/L。魏敏等[13]對副干酪乳桿菌耐受乳酸能力的研究，發(fā)現(xiàn)菌株可以在高濃度乳酸溶液中達(dá)到極高的活菌濃度。

尋找合適的廢棄物或者廉價底料發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸[14-17]，不僅能夠降低污染[18]，實(shí)現(xiàn)資源的回收再利用，而且進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本，已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)領(lǐng)域。RUENGRUGLIKITC等[19]將玉米芯等農(nóng)業(yè)有機(jī)廢料作為發(fā)酵底料，利用乳酸菌作為發(fā)酵菌株，結(jié)果表明，乳酸的產(chǎn)率可達(dá)到300 g/kg。JINB等[20]利用少根根霉（Rhizopusarrhizus）DAR36017發(fā)酵玉米和土豆淀粉廢水產(chǎn)乳酸，結(jié)果表明，乳酸產(chǎn)量為19.5～44.3g/L。MIURAS等[21]用Bacillussp.與Rhizopussp.MK-96-1196混合培養(yǎng)，直接發(fā)酵未經(jīng)預(yù)處理的米糠等粗原料，結(jié)果表明，在100 g/L的粗原料中乳酸產(chǎn)量為24 g/L。在卷煙加工[22-24]、煙草薄片生產(chǎn)[25-28]過程中，均有大量富含可溶性糖、含氮化合物和礦物質(zhì)等成分[29-32]的高濃度煙草廢水產(chǎn)生，具有潛在資源化利用價值。

目前利用煙草廢水發(fā)酵制備L-乳酸的研究尚未見其他實(shí)驗(yàn)室報道[33-34]，因此，利用副干酪乳桿菌發(fā)酵煙草廢棄物制備L-乳酸具有巨大的開發(fā)潛力。本研究以分離鑒定的一株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）ZG19為出發(fā)菌株，對菌株ZG19發(fā)酵煙草廢水產(chǎn)乳酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為副干酪乳桿菌ZG19發(fā)酵煙草廢水規(guī)?；苽銵-乳酸和煙草廢水的資源化綜合利用提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌種

煙梗（直徑為0.30～0.50 cm，長度為4.0～5.0 cm）：天昌國際煙草有限公司。副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei）ZG19：由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉（分析純）：上海試四赫維化工有限公司；鹽酸（分析純）：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；酵母粉：英國OXOID公司；蛋白胨：鄭州創(chuàng)生生物科技公司；吐溫80（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、碳酸鈣（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；瓊脂粉：美國Sanland公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，檸檬酸三銨2g/L，葡萄糖20g/L，吐溫-801mL，乙酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，瓊脂1.8%。

液體種子培養(yǎng)基：同MRS培養(yǎng)基，不加瓊脂即可。

發(fā)酵培養(yǎng)基采用模擬煙草廢水培養(yǎng)基[35]：煙梗60℃烘干至恒質(zhì)量后用粉碎機(jī)粉碎成粉末狀，取30 g煙梗粉末放入500 mL三角瓶，加入300 mL的蒸餾水（100℃），180 r/min振蕩30 min后抽濾，濾液即為模擬煙草廢水培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

SYQ-DS2X-280B高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；TGL-16C臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；MP200A電子天平：上海精科天平儀器廠；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；PHS-3C精密pH計(jì)：上海鵬順科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

從MRS斜面培養(yǎng)基上挑取副干酪乳桿菌ZG19菌種，接入裝液量為100 mL/250 mL液體種子培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)14 h。

1.3.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用N=12的Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)對初選的影響ZG19發(fā)酵煙草廢水產(chǎn)L-乳酸的7種相關(guān)因素：發(fā)酵溫度、發(fā)酵液初始pH、發(fā)酵時間、裝液量、接種量、CaCO3含量、發(fā)酵方式進(jìn)行考察分析，以L-乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，每種因素取高（+）、低（-）兩個水平，并余出4個空白項(xiàng)作為誤差分析，高水平倍數(shù)不超過低水平2倍，因素之間間隔分布，7種因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB試驗(yàn)選取對L-乳酸產(chǎn)量影響最顯著的3個因素：發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，由于這3個因素對白僵菌孢子產(chǎn)量都有明顯的正效應(yīng)，因此將其含量逐漸增加以此來尋找最佳響應(yīng)區(qū)域，而發(fā)酵方式具有明顯的負(fù)效應(yīng)，所以采用靜置發(fā)酵方式。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定變化方向與步長，具體設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of the steepest ascent experiments

1.3.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)主要采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法來進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。通過Plackett-Burman試驗(yàn)確定發(fā)酵過程中影響L-乳酸產(chǎn)量的3個主要因素：發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）和接種量（C），進(jìn)一步設(shè)計(jì)爬坡試驗(yàn)逼近最優(yōu)條件附近，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化分析，各因素與水平取值見表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每個處理設(shè)置3個重復(fù)，采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表1選取的7個因素和水平進(jìn)行PB試驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。從表4可以看出，L-乳酸產(chǎn)量響應(yīng)值最小值為2.28 g/L，最大值為8.59 g/L，變化幅度較大，差別明顯，表明所選因素的改變對L-乳酸的產(chǎn)量有顯著影響。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

2.1.2 PB試驗(yàn)各因素效應(yīng)分析

各因素的影響度和模型貢獻(xiàn)率如表5所示。影響度是指模型中的某個因素從低水平（-1）向高水平（+1）變化時對模型響應(yīng)值所產(chǎn)生的影響，其中負(fù)值表示該因素對響應(yīng)值具有負(fù)效應(yīng)，并且影響度值越大說明該影響因子對響應(yīng)值的影響越顯著[36]。貢獻(xiàn)率是指模型中某因素的平方和占模型中各因素平方和的總和的百分比，其值大小表明了該因素對響應(yīng)值影響程度的大小，貢獻(xiàn)度越大表明該因素變量在模型中的作用越大[37]。從表5可看出，不同因素差別很大，其中接種量的影響度和貢獻(xiàn)率均最高，分別為1.83和34.87%，其次為發(fā)酵溫度，影響度和貢獻(xiàn)率分別為1.50和23.34%，時間對L-乳酸產(chǎn)量的影響僅次于接種量和溫度。接種量影響發(fā)酵延滯期的時間[38]，發(fā)酵溫度對菌株的生長和發(fā)酵具有重要作用，發(fā)酵時間則會影響發(fā)酵產(chǎn)物的積累。此外，發(fā)酵方式對L-乳酸的產(chǎn)生積累具有明顯的負(fù)效應(yīng)，表明菌株ZG19發(fā)酵產(chǎn)乳酸是一個厭氧過程，增加轉(zhuǎn)速導(dǎo)致發(fā)酵液溶氧增加，抑制乳酸的合成。

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)因素效應(yīng)分析Table 5 Factors effect analysis of Plackett-Burman experiments

2.1.3 PB試驗(yàn)結(jié)果方差分析

對PB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。P值表示樣本間差異的顯著性水平，P＜0.05表明樣本之間具有顯著差異，P＜0.01表明樣本間的差異極顯著。由表6可知，本模型的P＜0.001，表明該模型高度顯著，在整個回歸區(qū)域里擬合度良好，具有實(shí)際意義，可用來評估各個因素對L-乳酸產(chǎn)量的影響。在所選取的因素中，發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵時間、接種量的P值均小于0.01，表明這些因素對ZG19發(fā)酵煙草廢水產(chǎn)L-乳酸都有極其顯著的影響，其中發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵時間、接種量具有顯著的正效應(yīng)，發(fā)酵方式則具有顯著的負(fù)效應(yīng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)各因素影響度、貢獻(xiàn)率和方差分析綜合評價，確定發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量為副干酪乳桿菌ZG19發(fā)酵煙草廢水產(chǎn)L-乳酸的主要正效應(yīng)因子，發(fā)酵方式為主要負(fù)效應(yīng)因子。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中采取靜置發(fā)酵方式，并對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量做進(jìn)一步優(yōu)化。

表6 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，對菌株ZG19發(fā)酵煙草廢水產(chǎn)L-乳酸影響最顯著的3個正效應(yīng)因素：發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of the steepest ascent experiments

由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量的增加，L-乳酸產(chǎn)量逐漸升高，并且不同試驗(yàn)組對L-乳酸產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）。在發(fā)酵溫度38℃，發(fā)酵時間32 h，接種量（第5組）10%時，L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到最大值。因此，選取此條件為中心點(diǎn)，每個因素取3水平，以（-l，0，1）編碼，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，以篩選出發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量的最優(yōu)配比。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

對選取的3種主要效應(yīng)因素發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）和接種量（C）進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)值為L-乳酸產(chǎn)量（Y），設(shè)置17個試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個試驗(yàn)點(diǎn)為析因點(diǎn)，其余5個試驗(yàn)點(diǎn)為零點(diǎn)，結(jié)果見表7。

以L-乳酸產(chǎn)量作為響應(yīng)值，根據(jù)表7中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，進(jìn)行二次回歸分析，得到回歸方程為Y=-460.50000+9.37500A+5.90625B+40.62500C-0.03125AB+0.125 0AC+0.0109 2BC-0.1250 0A2-0.0781 25B2-2.25C2。對回歸方程各項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。從表8可以看出，模型的P值＜0.000 1，說明此模型具有極高的顯著性，并且經(jīng)過校正后回歸方程決定系數(shù)R2Adj為98.69%，表明方程的擬合度良好，變異系數(shù)為1.44%，值較小，表明試驗(yàn)結(jié)果可靠。

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of the regression model

2.3.2 響應(yīng)面分析及最佳發(fā)酵條件的確定

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面和等高線圖，結(jié)果如圖2所示，從圖2可以看出，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間的交互作用以及發(fā)酵溫度、接種量的交互作用明顯，而發(fā)酵時間和接種量之間的交互作用不明顯。從響應(yīng)面圖和模型分析可知回歸方程存在最大值，得到最優(yōu)條件為：發(fā)酵溫度38.80℃，發(fā)酵時間30.04 h，接種量10.11%時，L-乳酸產(chǎn)量理論最優(yōu)值為15.35 g/L。

圖2 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量相互作用對L-乳酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and inoculum on L-lactic acid yield

2.3.3 模型驗(yàn)證

通過Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化得到副干酪乳桿菌ZG19發(fā)酵煙草廢水產(chǎn)L-乳酸的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度38.80℃，發(fā)酵時間30.04 h，接種量10.11%時，L-乳酸產(chǎn)量理論最優(yōu)值為15.35 g/L。為方便實(shí)際操作，在發(fā)酵溫度39℃，發(fā)酵時間30 h，接種量10%條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到實(shí)際L-乳酸產(chǎn)量為15.16 g/L（3次重復(fù)平均值），與模型預(yù)測值擬合度達(dá)到98.76%，表明通過響應(yīng)面法對副干酪乳桿菌ZG19發(fā)酵煙草廢水產(chǎn)L-乳酸工藝條件的優(yōu)化合理而有效，具有實(shí)際意義。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）ZG19發(fā)酵煙草廢水產(chǎn)L-乳酸的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度39℃，發(fā)酵時間30 h，接種量10%時，靜置發(fā)酵，實(shí)際L-乳酸產(chǎn)量為15.16 g/L，與模型預(yù)測最優(yōu)值（15.35 g/L）擬合度達(dá)到98.76%，相比PB試驗(yàn)L-乳酸產(chǎn)量顯著提高達(dá)到了76.5%。本研究探究并優(yōu)化了副干酪乳桿菌ZG19發(fā)酵煙草廢水產(chǎn)L-乳酸的發(fā)酵工藝，顯著提高了L-乳酸產(chǎn)量，具有良好的開發(fā)潛力和應(yīng)用價值，為煙草廢水、煙草廢料的資源化利用開辟了新途徑。

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