王 瑩，劉鳳霞，趙 印，李慧星，薛 剛*，李 津

（1.南陽理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽 473004；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473004；3.河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司 車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473000）

自1970年石油危機(jī)以來，全球酒精產(chǎn)量急劇增加。我國是酒精生產(chǎn)大國，產(chǎn)量僅次于美國、巴西和歐盟，約占全球總產(chǎn)量的3%[1]。然而酒精生產(chǎn)會(huì)伴隨著大量廢水的產(chǎn)生，且廢水有化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）、生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）、懸浮物濃度高的特點(diǎn)[2-3]。酒精廢水的主要治理技術(shù)是厭氧消化，其既可以有效消化降解廢水中的有機(jī)物，實(shí)現(xiàn)降低廢水中COD和BOD等指標(biāo)，又可以生產(chǎn)清潔能源物質(zhì)—沼氣，提供能量[1，3]。然而酒精廢水經(jīng)過厭氧消化處理后，厭氧出水中仍含有一定量的有機(jī)物，包括難以消化的化合物、厭氧微生物的代謝產(chǎn)物等，厭氧出水中COD和BOD仍分別有1 000～2 000 mg/L和500～700 mg/L，還含有氨氮、磷酸鹽等無機(jī)鹽類。因此，厭氧出水仍需進(jìn)一步處理才能達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)，通常采用好氧曝氣工藝來降低厭氧出水中的COD和BOD，并達(dá)到脫磷除氨的目的[4-6]。

氧化溝是一種首尾相連的循環(huán)流曝氣溝渠，自1954年在荷蘭首次投入使用以來，由于其具有出水水質(zhì)好、抗沖擊負(fù)荷能力強(qiáng)等技術(shù)特點(diǎn)，已在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用[7]。氧化溝的高效運(yùn)行主要依賴于好氧活性污泥的微生物菌群，所以氧化溝活性污泥（簡稱好氧污泥）的微生物菌群研究受到了學(xué)者們的極大關(guān)注，尤其是全基因組測序技術(shù)的應(yīng)用，它對全面了解污泥的微生物菌群有著重要的作用，在揭示污泥的主要微生物種群、分析工藝因素對微生物菌群種類和分布的影響、豐富微生物菌群的基礎(chǔ)理論知識等方面有重要意義[6，8-10]。ZHANG T等[9]應(yīng)用Rocher 454測序分析了14個(gè)樣本的好氧污泥，其中樣本取自于不同國家（中國、美國和加拿大等）的城市污水處理廠。研究結(jié)果表明，盡管多數(shù)樣本含有相同的菌屬（如Caldilinea，Tricoccus，Prosthecobacter，Zoogloea和Dechloromonas），但不同樣本的微生物菌群種類和分布區(qū)別很大，這是由于pH、溫度和有機(jī)負(fù)荷等因素造成的。ZHENG M等[8]基于Illumina MiSeq測定方法分析好氧污泥的微生物菌群，闡釋減少氧化溝工藝中N2O釋放量的生物機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，污泥中含有一定量硝化菌和反硝化菌，這些菌群在降低N2O生成起著重要作用。IBARBALZFM等[10]應(yīng)用Rocher 454測序方法分析并比較8種廢水（印染染料廢水、石油煉制廢水、食品廢水等）處理工藝中好氧污泥的微生物菌群，研究表明好氧污泥的微生物菌群種類和分布主要取決于處理廢水的類別和性質(zhì)。

全基因組測序技術(shù)有Sanger測序方法、Rocher 454測序方法和Illumina MiSeq測序方法等，其中Illumina MiSeq測序方法由于其操作簡便、價(jià)格低廉和準(zhǔn)確率高等優(yōu)勢[11]，已廣泛并成功應(yīng)用于活性污泥[9，12]、土壤[13]、食品干酪[11]、海洋水[14]等樣本的微生物菌群分析。本實(shí)驗(yàn)采用Illumina MiSeq測序方法研究酒精廢水處理工藝中厭氧活性污泥和好氧污泥的微生物菌群，在屬（genus）水平分析微生物菌群的種類和豐度，參考已報(bào)道文獻(xiàn)來探討不同菌屬的特性和功能，以期為闡釋酒精廢水處理過程中氧化溝工藝的生物機(jī)制以及工藝的升級改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

好氧活性污泥：取樣于河南天冠集團(tuán)的氧化溝，從6個(gè)不同位置取樣后混合，保存于0℃條件下并快速移至-80℃冰箱中長期保存。SanPrep柱式脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；E.Z.N.A.Soil DNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；Qubit2.0DNA檢測試劑盒：美國Life公司；TaqDNA聚合酶：美國Thermo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MiSeq Illumina測序儀：美國Illumina公司；GL-88B漩渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：拓能達(dá)科技有限公司；Pico-21臺(tái)式離心機(jī)：美國Thermo Fisher公司；Bioprofile 300B多參數(shù)生化分析儀：美國Nova公司；GelDoc-ItTS3凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；Qubit 2.0熒光計(jì)：美國Invitrogen公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酒精廢水處理工藝流程

設(shè)計(jì)并采用厭氧、好氧和絮凝的工藝流程處理酒精廢水，其工藝流程：

1.3.2 DNA的提取

好氧活性污泥中微生物總DNA提取按照OMEGA試劑盒說明書中方法和步驟進(jìn)行。

1.3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

擴(kuò)增16S rDNA的V3-V4區(qū)域，PCR引物是Miseq測序平 臺(tái) 的 通 用 引 物 341F：5′CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG3′，805R：5′GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC3′。50μLPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系含有：10×PCR buffer（5 μL），脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（0.1 mmol/L），Genomic DNA（10 ng），PCR primer F（0.5 μmol/L），Primer R（0.5 μmol/L），Plantium Taq（0.05 U）。PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃，3 min后執(zhí)行94℃，30s、45℃，20s、65℃，30s共5個(gè)循環(huán)，然后執(zhí)行94℃、20s，45℃、20s，65℃、30s共20個(gè)循環(huán)，最后退火72℃、5min。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對DNA進(jìn)行回收。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，依托上海生工進(jìn)行DNA測序分析。

1.3.4 測定方法

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精廢水處理過程中主要指標(biāo)變化

在厭氧-好氧-絮凝工藝處理酒精廢水的過程中，主要指標(biāo)（COD、BOD-N、TP和pH）的變化趨勢如圖1所示。

圖1 酒精廢水處理過程的主要指標(biāo)變化Fig.1 Changes of main parameters during alcohol wastewater treatment process

由圖1可知，在酒精廢水處理過程中，pH的變化較小，總磷濃度（TP）不斷減小，-N濃度呈先升高后降低的趨勢，COD、BOD呈先快速減小后緩慢減小的趨勢。COD、BOD的變化主要發(fā)生在厭氧處理工序階段（工序1～5）；在氧化溝工序中（工序5～6），-N濃度顯著下降，COD、BOD和TP分別從（1 800±150）mg/L、（600±60）mg/L和（70±9）mg/L降至（500±30）mg/L，（65±5）mg/L和（40±5）mg/L。因此，酒精廢水處理工藝過程中氧化溝工序的主要作用是脫氮，并適當(dāng)降低COD、BOD和TP，為后續(xù)絮凝工序奠定基礎(chǔ)。

2.2 好氧污泥中測定序列和操作分類單元的數(shù)目

基于Illumina MiSeq方法測定處理酒精廢水好氧污泥中總序列為14 966個(gè)，經(jīng)過質(zhì)量控制和嵌合體的去除，獲得有效序列13 967個(gè)。廢水的類別和性質(zhì)顯著影響好氧污泥的微生物菌群，表1列舉了不同好氧污泥通過全基因組測序獲得的序列數(shù)量、操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）、香農(nóng)指數(shù)和ACE指數(shù)。

表1 不同好氧污泥中序列數(shù)量、操作分類單元、香農(nóng)指數(shù)和ACE指數(shù)、覆蓋率的比較Table 1 Comparison of sequence amounts,operational taxonomic unit,Shannon index and ACE index

由表1可以看出，基于Illumina MiSeq方法測定處理酒精廢水好氧污泥中總序列為14 966個(gè)，經(jīng)過質(zhì)量控制和嵌合體的去除，獲得有效序列13967個(gè)。根據(jù)序列差異水平在0.03，即相似度97%的水平上構(gòu)建出操作分類單元（OTU）為1 308個(gè)，香農(nóng)指數(shù)和ACE指數(shù)分別為5.08和3 305，覆蓋率為95%。處理不同種類廢水的好氧污泥參數(shù)區(qū)別較大，而相同種類廢水的好氧污泥的參數(shù)區(qū)別較小。相比較于處理染料廢水、食品廢水和煉油廢水的好氧污泥，處理酒精廢水的好氧污泥的操作分類單元、香農(nóng)指數(shù)、ACE指數(shù)較高，但相比較于處理城鎮(zhèn)污水的好氧污泥，操作分類單元、ACE指數(shù)較低。結(jié)果表明，處理酒精廢水的好氧活性污泥的微生物多樣性高于處理染料、食品和煉油廢水的好氧活性污泥的微生物多樣性，但低于處理城鎮(zhèn)污水的好氧活性污泥的微生物多樣性。

2.3 好氧污泥的菌群分析

在屬（genus）的水平上對處理酒精廢水的好氧污泥的微生物類群進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)菌屬的豐度，結(jié)果如表2所示。

表2 處理酒精廢水的好氧污泥中各菌屬及其豐度Table 2 Bacterial genus and their abundance in the aerobic sludge of treated alcohol wastewater

由表2可知，處理酒精廢水的好氧污泥微生物種類繁多，所以每個(gè)菌屬豐度相對較小，豐度最大值為9%。另外，還有一定量菌屬尚不能分類，這與ZHANG T等[9]的研究結(jié)果一致。試驗(yàn)根據(jù)豐度將樣本中菌屬分為主要菌屬（豐度≥1.0%）和次要菌屬（豐度＜1.0%），且將次要菌屬歸類于其他，其中主要菌屬包括有熱單胞菌屬（Caldimonas）、束縛桿菌屬（Haliscomenobacter）、TM7、球形桿菌屬（Sphaerobacter）和厭氧繩菌屬（Bellilinea）等。參考研究報(bào)道分析主要菌屬的特性如下：

2.3.1 熱單胞菌屬（Caldimonas）

Caldimonas分類于變性菌門，變形菌綱，伯克氏菌目，叢毛單胞菌科。CHEN W M等[15]從溫泉中篩選得到菌株Caldimonas taiwanensis，研究指出，該菌株具有表達(dá)分泌胞外淀粉酶的特性。同樣，對菌株Caldimonasmeghalayensis[16]、Caldimonas hydrothermale[17]的研究表明，它們能夠利用淀粉作為碳源進(jìn)行生長和代謝。

2.3.2 束縛桿菌屬（Haliscomenobacter）

Haliscomenobacter分類于擬桿菌門，鞘脂桿菌綱，鞘脂桿菌目，腐螺旋菌科。研究表明，Haliscomenobacter是活性污泥中的絲狀細(xì)菌，造成污泥的生物膨脹[18-19]。

2.3.3 菌屬TM7

菌屬TM7廣泛分布于自然環(huán)境中（如土壤、溫泉，污泥和人體等），是典型的不可培養(yǎng)微生物，它的分類尚不確定[20-22]。然而，TM7的功能研究受到了學(xué)者們的極大關(guān)注，DINISJM等[20-21]研究表明，TM7與人類疾病有顯著的相關(guān)性。

2.3.4 球形桿菌屬（Sphaerobacter）

Sphaerobacter分類于綠彎菌門，熱微菌綱，球桿菌目，球形桿菌科。HUGENHOLTZP等[23]研究指出，Sphaerobacter thermophilus是嚴(yán)格好氧，革蘭氏陽性，無芽孢，無運(yùn)動(dòng)性，形狀不規(guī)則的桿菌。PATI A等[24]分析菌株Sphaerobacter thermophilus的全基因組，結(jié)果表明，基因組大小為3 993764bp，表達(dá)分泌3 525種蛋白，其中包括過氧化氫酶、氧化酶和淀粉水解酶等。此外，陳春等[25]研究表明，SphaerobacterA1具有苯酚降解能力。

2.3.5 厭氧繩菌屬（Bellilinea）

Bellilinea分類于綠彎菌門，厭氧繩菌綱，厭氧繩菌目，厭氧繩菌科。YAMADAT等[26]描述菌株Bellilineacaldifistulae能夠利用多種碳水化合物作為碳源，如葡萄糖、核糖和甘露糖等，當(dāng)Bellilinea caldifistulae與氫營養(yǎng)型甲烷菌共培養(yǎng)時(shí)，菌株生長和代謝得到顯著的強(qiáng)化。

2.3.6 嗜酸土生單胞菌屬（Aciditerrimonas）

Aciditerrimonas分類于放線菌門，放線菌綱，酸微菌目，酸微菌科。Aciditerrimonas常發(fā)現(xiàn)于富含無機(jī)鹽的酸性環(huán)境中，兼性厭氧，ITOH T等[27]研究表明，Aciditerrimonas ferrireducens是一株嗜酸放線菌，在有氧條件下，菌株以多種碳水化合物，如葡萄糖、乳糖和麥芽糖等為底物進(jìn)行生長和代謝，在無氧條件下，能夠利用Fe3+和H2進(jìn)行自養(yǎng)生長。

2.3.7 生絲微菌屬（Tetrasphaera）

Tetrasphaera分類于放線菌門，放線菌綱，放線菌目，間孢囊菌科。Tetrasphaera在活性污泥中對磷元素的脫除具有重要的作用[28-30]。HANADA S等[28]篩選分離得到菌株Tetrasphaera elongata，菌株胞內(nèi)能夠觀察到明顯的多聚磷酸鹽顆粒。KRISTIANSEN R等[29]對4株菌株T.australiensis，T.japonica，T.elongata和T.jenkinsii的基因組進(jìn)行測序分析，并構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)，研究表明在好氧條件下，Tetrasphaera通過糖代謝產(chǎn)生能量供菌株生長和多聚磷酸鹽顆粒的形成，在厭氧條件下，菌株生長和代謝的能量主要供體是多聚磷酸鹽顆粒。

2.3.8 陶厄氏菌屬（Thauera）

Thauera分類于變形菌門，β-變形菌綱，紅環(huán)菌目，紅環(huán)菌科。Thauera對氮元素的去除具有重要的作用，且可以降解芳香類化合物[31-33]。SCHOLTEN E等[31]篩選分離得到一株反硝化菌Thauera mechernichensis，該菌株可以利用芳香類化合物作為底物進(jìn)行代謝。SHINODA Y等[32]研究表明反硝化菌Thauerasp.DNT-1能夠在厭氧或好氧條件下以甲苯為唯一碳源進(jìn)行生長代謝。BIEGERT T等[33]研究表明，反硝化菌Thauera aromatica以甲苯和琥珀酸為底物，代謝生成琥珀酸芐酯。

2.3.9 土壤桿菌屬（Spartobacteria）

Spartobacteria分類于疣微菌門，尚未分類于確定的目和科。然而，該菌屬廣泛分布于水生環(huán)境中，如BERGEN B等[34]研究指出Spartobacteria占波羅地海細(xì)菌菌群的比例達(dá)到12%。HERLEMANN D P R等[35]分析Spartobacteria的全基因組，研究表明Spartobacteria是一類好氧異養(yǎng)菌，對生態(tài)環(huán)境中的C素循環(huán)起著重要的作用，能夠代謝多種碳水化合物，包括纖維素、淀粉、幾丁質(zhì)等。

2.3.10 微酸菌屬（Ilumatobacter和Iamia）

Ilumatobacter分類于放線菌門，放線菌綱，酸微菌目，酸微菌科。Iamia分類于放線菌門，放線菌綱，酸微菌目，唇形科。微酸菌目菌株是革蘭氏陽性，多數(shù)好氧、耐溫和耐酸，能夠利用檸檬酸、葡萄糖、麥芽糖等多種碳源進(jìn)行生長和代謝。如MATSUMOTO A等[36-37]從河水污泥和海濱沙灘中分離篩選得到菌株Ilumatobacter fluminis，Ilumatobacter nonamiense和Ilumatobacter coccineum。KURAHASHI M等[38]從紅黑海參的腹部表皮分離篩選得到的Iamia majanohamensis。

2.3.11 沙雷氏菌屬（Serratia）

Serratia分類于變形菌門，γ-變形菌綱，腸桿菌目，腸桿菌科。關(guān)于菌屬Serratia的產(chǎn)色素特性已有許多研究報(bào)道[39]。此外，菌屬Serratia具有代謝多種結(jié)構(gòu)頑固、復(fù)雜有機(jī)物的特性，引起了學(xué)者們的極大關(guān)注。PAKALA S B等[40]以甲基對硫磷作為唯一碳源篩選得到菌株Serratiasp.DS001，研究表明該菌株表達(dá)分泌甲基對硫磷水解酶和硝基酚羥化酶，降解和代謝甲基對硫磷、ρ-硝基酚，4-硝基鄰苯二酚和1,2,4-苯三酚。WRIGHT S J等[41]從活性污泥中篩選得到Serratia marcescens，該菌株能夠降解α-菘萜，代謝產(chǎn)物有馬鞭草烯醇和索布瑞醇。此外，毒死蜱[42]、香草醛[43]等化合物也能夠被菌屬Serratia降解和代謝。

2.3.12 紅桿菌屬（Rhodobacter）

Rhodobacter分類于變形菌門，α-變形菌綱，紅桿菌目，紅桿菌科。菌屬Rhodobacter中的代表性菌株是Rhodobacter sphaeroides，該菌株是紫色非硫細(xì)菌，在好氧條件下它可以化能生長；但當(dāng)氧分壓降低時(shí)，細(xì)胞可以通過光合磷酸化反應(yīng)獲取能量[44-45]，能夠表達(dá)分泌固氮酶和氫化酶，在生產(chǎn)H2方面具有重要的作用。另外，能夠表達(dá)分泌固氮酶、氫化酶并具有產(chǎn)氫能力的還有Rhodobacter monas，Rhodobacter capsulatus等菌株[45]。

2.3.13 疣微菌屬（Haloferula）

Haloferula分類于疣微菌門，疣微菌綱，疣微菌目，疣微菌科。KANG H等[46]篩選得到菌株Haloferula chungan gensis，菌株具有桿狀、革蘭氏陰性和嚴(yán)格好氧的特性，可以代謝多種糖類化合物。YOON J等[47]從海洋中分離出5株Haloferula屬但不同種的菌株，分別是Haloferula rosea，Haloferula harenae，Haloferula phyci，Haloferula helveola和Haloferula sargassicola，它們同樣具有桿狀、革蘭氏陰性和嚴(yán)格好氧的特性。特別的是，5種菌株均具有產(chǎn)色素的特性，如菌株Haloferula harenae產(chǎn)色素的吸收波長為446 nm和472 nm；菌株Haloferula rosea產(chǎn)色素的吸收波長為494 nm和524 nm。

3 結(jié)論

在酒精廢水處理過程中，pH的變化較小，總磷（TP）濃度不斷減小，-N濃度呈先升高后降低的趨勢，化學(xué)需氧量（COD）、生化需氧量（BOD）呈先快速減小后緩慢減小的趨勢。氧化溝工序的主要作用是脫氮，并適當(dāng)降低COD、BOD和TP，為后續(xù)絮凝工序奠定基礎(chǔ)。廢水的類別和性質(zhì)顯著影響好氧污泥的微生物菌群種類和豐度[10]。Illumina MiSeq測序充分展示了酒精廢水處理工藝中好氧污泥的微生物菌群多樣性，分析表明處理酒精廢水的好氧污泥的微生物多樣性高于處理染料、食品和煉油廢水的好氧活性污泥的微生物多樣性，但低于處理城鎮(zhèn)污水的好氧活性污泥的微生物多樣性。菌群分析結(jié)果表明，生絲微菌屬（Tetrasphaera，豐度2%）通過在生成胞內(nèi)多聚磷酸鹽顆粒，對廢水中磷元素的去除起重要作用；陶厄氏菌屬（Thauera，豐度2%）對氮元素的去除起重要的作用，其可將NO3-中的N元素通過一系列中間產(chǎn)物（NO2-、NO、N2O）還原為N2。球形桿菌屬（Sphaerobacter，豐度3%）、陶厄氏菌屬（Thauera，豐度2%）、沙雷氏菌屬（Serratia，豐度1%）對結(jié)構(gòu)頑固、復(fù)雜的化合物表現(xiàn)出生物降解或轉(zhuǎn)化的能力，可能是降低廢水中COD和BOD的主要微生物。熱單胞菌屬（Caldimonas）在污泥中豐度高，但其特性和功能尚不清晰，有待更加深入地研究。

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