林敬杰，嚴(yán) 凱，桂 娟，徐一涵，張建華*

（1.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240；2.上海交通大學(xué) 分析測(cè)試中心，上海 200240）

茶皂素是山茶科山茶屬植物中的一類齊墩果烷型三萜類皂苷的混合物，基本結(jié)構(gòu)有齊墩果烷型配體、糖基及小分子有機(jī)酸等，其化學(xué)結(jié)構(gòu)試如下：

配體與有機(jī)酸的連接是通過配體環(huán)上的羥基與有機(jī)酸的羧基酯化而成的，有機(jī)酸多為當(dāng)歸酸和醋酸等[1]。糖基與配體通過配體上的羰基與糖基上的羥基以糖苷鍵形式結(jié)合[2]，糖基有葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖和半乳糖等。從分子結(jié)構(gòu)上看，茶皂素的結(jié)構(gòu)可分為親水基團(tuán)和親油基團(tuán)兩部分，其親水基團(tuán)是由電負(fù)性很強(qiáng)的的含氧基團(tuán)構(gòu)成，主要集中在茶皂素的糖基配體，有機(jī)酸配體以及皂苷配基的連接部位，而五環(huán)三萜骨架是由非極性的碳?xì)洵h(huán)鏈構(gòu)成，在水溶液中呈現(xiàn)疏水傾向，為親油基團(tuán)的主體。

茶皂素具有兩親性，可與紅細(xì)胞細(xì)胞壁上膽甾醇絡(luò)合形成不溶于水的復(fù)合物沉淀，破壞細(xì)胞滲透壓，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞破裂，引發(fā)溶血[3-4]。朱全芬等[5]發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了茶皂素溶血性的魚毒作用；YOSHIKAWA M等[6]測(cè)得茶皂素的溶血指數(shù)可達(dá)到105，對(duì)魚類等冷血?jiǎng)游锶苎拘院艽?，但?duì)豬、牛、羊等溫血?jiǎng)游锒拘韵鄬?duì)較弱。

茶皂素易溶于含水甲醇、含水乙醇、正丁醇及冰醋酸、醋酐和吡啶[7-9]，而苷元易溶于乙酸乙酯。殷敏敏等[10]依次通過石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取青陽參根莖，并在乙酸乙酯中分離到14種物質(zhì)，其中包含10種苷元成分。CHAICHAROENPONGA C等[11]用硅膠吸附，以乙酸乙酯∶甲醇∶水（6∶3∶1.5（V/V））為洗脫液可分離茶籽粉提取液中的皂苷，并通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)其做了定量分析。

茶籽粕富含營養(yǎng)成分，但茶皂素的溶血性卻限制了其作為飼料的工業(yè)價(jià)值。茶皂素的糖苷鍵可被酸、堿或酶水解成糖與苷元。在酸性條件下，3號(hào)位的糖苷鍵斷裂；而在堿性條件下，16、18、21、22位的酯鍵斷裂[12]。尹麗茸等[13]證明了β-D-葡萄糖醛酸苷酶（β-D-glucuronidase）水解能降低茶籽粕的溶血性，并利用產(chǎn)β-D-葡萄糖醛酸苷酶的面包乳桿菌和枯草芽孢桿菌對(duì)茶籽粕固體發(fā)酵，極大地降低了粕的溶血性。β-D-葡萄糖醛酸苷酶是一種能催化β-D-葡萄糖醛酸苷鍵水解的糖苷類水解酶[12]。從茶皂素的結(jié)構(gòu)上可以看出，其五環(huán)三萜骨架與糖基以葡糖醛酸鍵相連[14-16]，若利用酶解法去除皂苷的糖體配體，可能會(huì)很大程度上降低皂苷的兩親性，繼而減弱茶皂素的溶血性。本實(shí)驗(yàn)通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）對(duì)酶解前后茶皂素結(jié)構(gòu)以及糖基和苷元相對(duì)含量的改變進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶解對(duì)茶皂素結(jié)構(gòu)的影響，探討溶血性降低的作用機(jī)理。如果β-D-葡萄糖醛酸苷酶可以降解茶皂素，下一步即可篩選產(chǎn)該酶的微生物菌種或構(gòu)建產(chǎn)酶的基因工程菌，探索茶籽粕發(fā)酵脫毒的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

99%茶皂素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-D-葡萄糖醛酸酶（350 U/mL）：美國Sigma公司；無水乙酸鈉、冰乙酸、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、無水乙醇均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8D型電熱恒溫水槽：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Mili-Q型超純水系統(tǒng)：德國Merck公司；5415D型微量臺(tái)式離心機(jī)：德國Eppendorf公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；ACQUITY UPLC超高效液相-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茶皂素的酶解

取0.25 g茶皂素溶于2 mL的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇中，用振蕩器混合20 s，加入2 mL醋酸鈉-醋酸緩沖液（pH 5.0）以及1 mL的β-D-葡萄糖醛酸酶混勻，于37℃反應(yīng)24 h。以酶解物的正丁醇提取液和乙酸乙酯提取液為樣品，以未酶解的茶皂素相應(yīng)提取液為對(duì)照組。

1.3.2 乙酸乙酯-正丁醇轉(zhuǎn)萃法

往反應(yīng)液中加入1 mL的乙酸乙酯，充分振蕩后，靜置15 min，然后取上層清液。此步驟重復(fù)6次，合并收集到的上層清液。在剩余的反應(yīng)液中加入1 mL的正丁醇充分振蕩后，靜置15 min，然后取上層清液，此步驟同樣重復(fù)6次，合并收集到的上層清液。將乙酸乙酯萃取液在30℃進(jìn)行真空濃縮，接近蒸干后，加入15 mL甲醇，繼續(xù)蒸發(fā)濃縮，用甲醇將濃縮液體積調(diào)為500 μL。將正丁醇的萃取液于60℃進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，接近蒸干后，加入15 mL甲醇，然后于30℃蒸發(fā)濃縮，用甲醇將濃縮液體積調(diào)為500 μL。

1.3.3 UPLC-MS條件

液相色譜條件：色譜柱規(guī)格：Waters AcquityBEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：45℃；紫外檢測(cè)波長：254 nm；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相A：含有0.1%甲酸的水，流動(dòng)相B：含有0.1%甲酸的乙腈。流速0.4 mL/min，洗脫梯度程序見表1。

質(zhì)譜條件：離子方式：負(fù)離子模式；質(zhì)量范圍（m/z）：50～2 000；毛細(xì)管電壓：2 800 V；錐孔電壓：50.0 V；離子源溫度：115℃；去溶劑溫度：350℃；去溶劑氣流：700 L/h；掃描時(shí)間：0.3 s。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of liquid chromatogram

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

峰面積比例計(jì)算：本實(shí)驗(yàn)對(duì)UPLC-MS結(jié)果進(jìn)行了分析，首先通過軟件積分得到總峰面積，再將非茶皂素的雜質(zhì)峰剔除，并且過濾掉峰面積＜80且峰型不佳的峰，以剩余峰的峰面積和為總峰面積，計(jì)算各個(gè)峰面積的百分比。其計(jì)算公式如下：

式中：n為茶皂素總組分?jǐn)?shù)。

乙酸乙酯萃取部分糖苷型茶皂素的百分比即為該部分中所有糖苷型茶皂素百分比之和，其余類推。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解前后樣品的組分及其峰面積分析

茶皂素樣品及酶解后試樣的UPLC分離結(jié)果見圖2～圖5，從各組分的出峰時(shí)間和峰面積的差異判斷，酶解前后體系的物質(zhì)組成存在明顯差異，其中部分峰型酶解前后物質(zhì)的含量提高2倍以上或者降至50%以下。酶解前后茶皂素乙酸乙酯萃取液與正丁醇萃取液中各組分的峰面積對(duì)比見表2和表3。

圖2 茶皂素乙酸乙酯萃取液UPLC色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of tea saponin extracted by ethyl acetate

圖3 茶皂素酶解物乙酸乙酯萃取液UPLC色譜圖Fig.3 UPLC chromatogram of tea saponin hydrolysate extracted by ethyl acetate

圖4 茶皂素正丁醇萃取液UPLC色譜圖Fig.4 UPLC chromatogram of tea saponin extracted by n-butyl alcohol

圖5 茶皂素酶解物正丁醇萃取液UPLC色譜圖Fig.5 UPLC chromatogram of tea saponin hydrolysate extracted by n-butyl alcohol

表2 酶解前后乙酸乙酯萃取液中茶皂素各組分的峰面積對(duì)比Table 2 Peak area comparison of components in tea saponin extracted by ethyl acetate before and after enzyme treatment

表3 酶解前后正丁醇萃取液中茶皂素各組分的峰面積對(duì)比Table 3 Peak area comparison of components in tea saponin extracted by n-butyl alcohol before and after enzyme treatment

由表2表3結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取液中，出峰時(shí)間分別為4.96 min、5.08 min、6.29 min、7.60 min和7.82 min等組分的峰面積出現(xiàn)較大變化。正丁醇萃取液中，出峰時(shí)間分別為2.62 min和5.42 min的組分，酶解前后峰面積差異很大。

2.2 茶皂素樣品及酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析

通過Chemspider數(shù)據(jù)庫對(duì)各個(gè)組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，系統(tǒng)推薦的可能的茶皂素結(jié)構(gòu)式見表4、表5。

表4 乙酸乙酯萃取液中各組分的茶皂素組成Table 4 Compositions of tea saponins extracted by ethyl acetate

表5 正丁醇萃取液中各組分的茶皂素組成Table 5 Compositions of tea saponins extracted by n-butyl alcohol

酶解前乙酸乙酯萃取組分中糖苷型茶皂素合計(jì)為75.06%，由表2和表4可知，主要的糖苷型分子有C53H84O25（3.80 min）、C58H92O26（5.39 min）、C58H92O27（5.69 min）、C58H90O26（6.41 min）、C59H92O26（7.06 min）和C63H98O28（8.66 min）等，在酶解前峰面積百分比分別為13.35%、8.01%、5.10%、2.72%、7.94%和15.25%，合計(jì)為52.37%。酶解后上述組分的峰面積百分比分別為1.26%、1.33%、0、0、1.42%和1.23%，合計(jì)為5.24%，可見酶解后糖苷型的含量明顯減少。

乙酸乙酯萃取組分中主要苷元的分子式為C29H44O6（3.67 min）、C30H48O7（4.12 min）、C31H48O7（4.95 min）、C29H46O6（5.09 min）、C30H48O6（6.29 min）、C31H50O7（7.60 min）、C35H56O8（7.62 min）和C36H58O9（9.07 min）等，酶解前峰面積百分比分別為4.33%、0.80%、0.09%、0.93%、0、0.50%、0和0.11%，合計(jì)為6.76%；酶解后上述組分峰面積百分比分別為4.65%、4.10%、10.72%、4.74%、13.31%、16.28%、8.63%和4.62%，合計(jì)為67.05%?？梢娒附夂筌赵暮匡@著增加。

酶解前后正丁醇萃取組分中皂苷形式的茶皂素分別合計(jì)為61.66%和47.17%。由表5可知，正丁醇萃取組分中主要的茶皂素分子均為糖苷型，有C54H86O26（3.74 min）、C53H82O25（3.95min）、C58H90O26（5.11min）、C59H96O26（5.68min）、C59H92O26（5.42min）、C63H98O28（8.66min）和C53H84O25（3.79min）等，酶解前峰面積百分比分別為5.35%、7.42%、2.30%、0、7.94%、15.25%和13.35%，合計(jì)為51.61%；酶解后上述組分的峰面積百分比分別為2.98%、3.84%、1.56%、1.39%、4.52%、10.52%和10.17%，合計(jì)為34.98%，酶解后正丁醇萃取組分中糖苷形式的茶皂素的含量也是顯著減少。糖基可能的分子式為C25H40O21，分子質(zhì)量與茶皂素常見的四糖結(jié)構(gòu)相同，酶解前后峰面積占比分別為2.47%和4.98%（見表3），可見糖基的含量也有提高。上述結(jié)果表明，酶解前茶皂素以糖苷型為主，酶解后以苷元型為主，且四糖含量明顯增加，說明β-D-葡萄糖醛酸苷酶的作用位點(diǎn)就是連接茶皂素中糖基與苷元成分的糖苷鍵。本研究的結(jié)果與王小燕等[17]關(guān)于β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化機(jī)理的論證，以及PODOLAK I等[18]通過酶解法去除皂苷的糖基配體，降低皂苷溶血性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[18]均相符。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯-正丁醇轉(zhuǎn)萃法對(duì)酶解前后的茶皂素進(jìn)行提取，再通過UPLC-MS分析方法對(duì)各組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)酶解前乙酸乙酯萃取組分中皂苷的峰面積占75.06%，苷元的峰面積僅占6.76%；酶解后皂苷的峰面積占5.24%，苷元的峰面積占67.05%。正丁醇萃取組分中茶皂素主要為皂苷類，酶解前的峰面積百分比61.66%，酶解后峰面積占47.17%。酶解前茶皂素混合物中以糖苷型為主，酶解后苷元及四糖含量明顯增加，說明β-D-葡萄糖醛酸苷酶的作用位點(diǎn)就是連接茶皂素中糖苷與苷元成分的糖苷鍵，這一研究結(jié)果為解釋?duì)?D-葡萄糖醛酸苷酶能有效降低茶皂素溶血性提供了理論依據(jù)。

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