杜 浩， 莊義慶， 黃 萍，3， 杜道林，3

(1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇句容 212013； 3.江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程研究院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

甜高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]最早起源于非洲，是粒用高粱的一個(gè)變種，其用途十分廣泛，其種子可以作為食物也可以飼用，其莖稈則是高質(zhì)量的青貯飼料。此外，甜高粱莖干中豐富的糖汁可以用于制糖和生產(chǎn)乙醇，而剩下的莖渣又是優(yōu)質(zhì)的造紙?jiān)牧?，因此甜高粱又有“高能作物”的美譽(yù)，受到越來越多學(xué)者的關(guān)注[1-4]。

然而，甜高粱的種質(zhì)資源匱乏，加上傳統(tǒng)的有性雜交育種具有不親和、育種周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，使得甜高粱的種植和使用受到了限制?，F(xiàn)代基因工程技術(shù)的發(fā)展，為甜高粱新品種的獲得提供了一種快速有效的途徑。Gao等認(rèn)為，甜高粱是禾本科中最難進(jìn)行組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的物種之一，獲得適應(yīng)性和實(shí)用性都較強(qiáng)的新品種較為困難[5]。目前，已開展較多的高粱遺傳轉(zhuǎn)化研究對(duì)甜高粱的功能基因分析、創(chuàng)建T-DNA插入突變體等具有重要的理論借鑒價(jià)值。本文針對(duì)甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化所必須考慮的幾個(gè)關(guān)鍵因素，就近些年來國內(nèi)外的研究工作進(jìn)行綜述，以期為甜高粱的遺傳轉(zhuǎn)化提供理論參考。

1 甜高粱基因型及外植體的選擇

與基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化不同，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化受基因型的限制比較大，成功獲得遺傳轉(zhuǎn)化的甜高粱品種不多且轉(zhuǎn)化率較低。目前已報(bào)道的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化的甜高粱基因型有二十幾種，而且不同基因型采用不同形式的受體材料，其轉(zhuǎn)化效率也各不相同(表1)。其中，研究最廣泛的是P898012、Tx430，轉(zhuǎn)化率分別可以達(dá)到33.0%、8.3%。

愈傷組織是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中最常用的一種外植體。Raghuwanshi等對(duì)32種甜高粱進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)增殖研究，發(fā)現(xiàn)Ramada、R9188及Wray較其他品種在愈傷組織誘導(dǎo)與再生方面具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，他們認(rèn)為選擇合適的甜高粱基因型獲取愈傷組織是成功獲得甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一[1]。除愈傷組織外，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化中，最常用的外植體有幼胚、莖尖分生組織及幼穗等(表1)。采用幼胚作為外植體時(shí)，理想大小為1.0～1.5 mm，時(shí)間為授粉后9～14 d[6-9]。Zhao等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)甜高粱P898012的幼胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，首次成功獲得甜高粱轉(zhuǎn)基因植株[6]。Carvalho等發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于預(yù)培養(yǎng)后的幼胚或者來源于幼穗的愈傷組織，農(nóng)桿菌對(duì)幼胚的侵染較容易，他們還發(fā)現(xiàn)受損傷的幼穗能夠抑制共培養(yǎng)中農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，不利于農(nóng)桿菌的侵染[10]。除幼胚外，莖尖分生組織也是一種理想的外植體。劉宣雨等以芽頂端分生組織建立了甜高粱的高頻、高效立體培養(yǎng)再生體系[11]。Yellisetty等采用SPV462的莖尖為外植體獲得了34%～38%的轉(zhuǎn)化率[12]。

2 受試材料的預(yù)處理

對(duì)甜高粱品種在農(nóng)桿菌浸染前后進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚恚兄谔岣咂滢D(zhuǎn)化效率。Carvalho等認(rèn)為，來源于最佳生長(zhǎng)條件下的幼胚在共培養(yǎng)后愈傷組織的形成狀態(tài)較好，而來源于水中或者干旱脅迫條件下的幼胚，在共培養(yǎng)階段會(huì)停止生長(zhǎng)甚至死亡[10]。Zhao等發(fā)現(xiàn)，野外種植的甜高粱幼胚的轉(zhuǎn)化率在 7.4%～10.1%，而溫室收獲幼胚的轉(zhuǎn)化率在0.95%～2.17%[6]，這與Lu等的研究結(jié)果相反，后者認(rèn)為采用來源于溫室的幼胚獲得的轉(zhuǎn)化率為1.4%，而野外獲得的幼胚轉(zhuǎn)化率僅為0.7%[7]。盡管對(duì)外植體的來源能否提高甜高粱轉(zhuǎn)化率還存在爭(zhēng)議，但可以認(rèn)為外植體的來源也是影響轉(zhuǎn)化率的一個(gè)重要因素。

Nguyen等發(fā)現(xiàn)，用4 ℃低溫對(duì)甜高粱品種Sensako 85/1191 幼胚預(yù)處理1 d， 外植體的成活率及愈傷組織的形成

表1 用于轉(zhuǎn)基因研究的不同品種甜高粱的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

注：bar表示雙丙氨膦抗性，gfp表示綠色熒光蛋白，gus表示β-葡萄糖苷酸酶，hpt表示潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，nptⅡ表示新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，manA表示磷酸甘露糖異構(gòu)酶，DsRed表示紅色熒光蛋白，yfp表示黃色熒光蛋白。

效果最佳，還可以有效降低培養(yǎng)基的更換頻率[8]。而Gurel等發(fā)現(xiàn)，將甜高粱品種P898012的幼穗在4 ℃放置0～5 d，放置5 d的甜高粱幼穗GFP表達(dá)率僅為放置0 d的28.4%[9]。如果在農(nóng)桿菌浸染前對(duì)幼胚進(jìn)行加熱處理會(huì)有助于提高GFP表達(dá)率，最佳處理?xiàng)l件為43 ℃預(yù)處理3 min，然后冷卻至室溫(25 ℃)并且不對(duì)愈傷組織進(jìn)行離心處理，可獲得GFP最高表達(dá)率，為49.1%，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率為8.3%。Gurel等接種前將幼胚在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使得GFP的表達(dá)率是在水中培養(yǎng)的2.67倍[9]。

3 培養(yǎng)基的成分

研究者對(duì)甜高粱培養(yǎng)基成分的改良主要集中在以下幾個(gè)方面：(1)減少酚類物質(zhì)產(chǎn)生。主要措施有選擇培養(yǎng)基類型、更換培養(yǎng)基，以及添加椰子汁、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、抗氧化劑(半胱氨酸和雙對(duì)氯苯基三氯乙烷等)、活性炭。(2)提高愈傷組織的質(zhì)量。主要措施是添加銅離子及激素。(3)添加乙酰丁香酮。

Raghuwanshi等發(fā)現(xiàn)，與DBC1、M11培養(yǎng)基相比，mM11培養(yǎng)基能夠獲得90%左右的胚性愈傷誘導(dǎo)率，顯著提高了愈傷組織的形成率[1]。Zhao等認(rèn)為，良好的愈傷組織是成功獲得甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化體的關(guān)鍵，通過對(duì)MS、N6培養(yǎng)基的比較研究發(fā)現(xiàn)，甜高粱在MS培養(yǎng)基上比在N6培養(yǎng)基上形成的愈傷組織更好且產(chǎn)生的酚類物質(zhì)更少，此外，他們認(rèn)為在培養(yǎng)基中添加椰子汁能有效抑制酚類物質(zhì)的產(chǎn)生[6]，這與Carvalho等的研究結(jié)果[10]相似，他們認(rèn)為在共培養(yǎng)基中添加椰子汁能提高幼胚的成活率和轉(zhuǎn)化效率。而Nguyen等卻認(rèn)為，添加椰子汁并未提高轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)他們?cè)谂囵B(yǎng)基中添加脯氨酸、脫落酸也并沒有產(chǎn)生額外的正面效應(yīng)[8]，這與Elkonin等的研究結(jié)果[13]并不一致。Gao等認(rèn)為，農(nóng)桿菌會(huì)產(chǎn)生使愈傷組織壞死的物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)添加1% PVPP或者頻換地更換培養(yǎng)基將有助于減少酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，促進(jìn)新鮮愈傷組織的生長(zhǎng)[5-6]。Lu等發(fā)現(xiàn)，PVPP較聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對(duì)愈傷組織的壞死和褐化具有更好的效果[7]，但Carvalho等則認(rèn)為，雖然培養(yǎng)基中添加PVPP可以減輕愈傷組織的褐化程度，卻不能降低幼胚的死亡率[10]?；钚蕴烤哂休^強(qiáng)的吸附性能，Nguyen等在培養(yǎng)基中添加活性炭發(fā)現(xiàn)，活性炭能有效減少黑色物質(zhì)的形成，顯著提高外植體的存活率，然而活性炭的添加會(huì)吸附培養(yǎng)基中的2，4-D等活性成分，從而降低幼胚的愈傷誘導(dǎo)率[8]。

Lu等在共培養(yǎng)基中添加抗氧化劑半胱氨酸和雙對(duì)氯苯基三氯乙烷(DDT)發(fā)現(xiàn)，遺傳轉(zhuǎn)化率會(huì)顯著降低[7]。而Pandey的研究則表明，共培養(yǎng)基中添加半胱氨酸，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，外植體的壞死率也會(huì)降低[14]。以上研究結(jié)果說明，半胱氨酸對(duì)轉(zhuǎn)基因效率的影響在不同甜高粱品種之間并不相同。Wu等在共培養(yǎng)基中添加低濃度的銅離子并且在篩選培養(yǎng)基中添加一定量的芐氨基腺嘌呤(BAP)，發(fā)現(xiàn)對(duì)提高甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化的質(zhì)量、生長(zhǎng)速度及轉(zhuǎn)基因愈傷組織的再生率都有很大的促進(jìn)作用[15]。

此外，外源添加乙酰丁香酮是影響甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一。植物受到損傷后會(huì)產(chǎn)生酚類物質(zhì)，乙酰丁香酮是雙子葉植物受傷后產(chǎn)生的主要酚類化合物之一，這些物質(zhì)會(huì)透過農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜活化和誘導(dǎo)VirA、VirG及其他Vir區(qū)基因的表達(dá)，從而將外源基因整合到植物的基因組中。而甜高粱缺少VIR介導(dǎo)化合物，這會(huì)降低農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化率。Gao等在農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，添加了 100 μmol/L 乙酰丁香酮，獲得了較高的轉(zhuǎn)化效率[5-6]。Jambagi等研究則表明，200 μmol/L乙酰丁香酮可以獲得最佳的轉(zhuǎn)化效率[16-17]。這說明乙酰丁香酮在不同甜高粱品種的遺傳轉(zhuǎn)化中的最佳作用濃度并不相同，具體需要根據(jù)甜高粱的基因型和農(nóng)桿菌的菌種來確定[18]。

4 篩選體系的選擇

理想的篩選體系是在盡可能完全快速地將未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或植株抑制或者殺死的同時(shí)盡可能多地保留轉(zhuǎn)化植株，因此篩選體系的選擇對(duì)甜高粱的遺傳轉(zhuǎn)化具有重要影響。篩選過程一般在甜高粱的再生階段進(jìn)行，也可以在植株開始分化后一段時(shí)間或者在轉(zhuǎn)化后進(jìn)行[19]。目前用于甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化的篩選體系主要有正向篩選體系和負(fù)向篩選體系。早在1987年，就有研究者將bar基因用于抗除草劑篩選基因篩選系統(tǒng)中，bar基因的表達(dá)能使轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生對(duì)草胺膦(PPT)、雙丙氨磷(bialaphos)、草丁膦(basta)等草甘膦類除草劑的抗性，這一類除草劑會(huì)阻斷未轉(zhuǎn)化植株的胺代謝途徑，毒害其生長(zhǎng)。在抗生素篩選體系中，主要應(yīng)用hpt和nptⅡ基因，這2種基因編碼氨基磷酸轉(zhuǎn)移酶，使轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生對(duì)卡那霉素、新霉素、巴龍霉素、潮霉素及G418等氨基糖苷類抗生素的抗性。篩選劑的濃度和篩選周期的選擇對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響較大，Lu等研究認(rèn)為，高濃度的篩選劑PPT(5 mg/L或者 10 mg/L)會(huì)產(chǎn)生酚類物質(zhì)而使幼胚褐化，以及抑制轉(zhuǎn)基因植株的再生，他們采用低濃度的篩選劑(2.5 mg/L PPT)配合較短的篩選周期(4～8周)，并且在生芽培養(yǎng)基中去除篩選劑，獲得了較高的陽性愈傷組織成活率[7]。

從表1中可以看出，在甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛采用負(fù)向篩選系統(tǒng)。然而，Gao等研究認(rèn)為，bar基因雖然在篩選轉(zhuǎn)基因植株中具有較大的優(yōu)勢(shì)，但它可以通過甜高粱與其野生近緣種的天然雜交而逃逸到環(huán)境中，產(chǎn)生抗除草劑的“超級(jí)雜草”[20]。因此，近年來人們把目光轉(zhuǎn)向正向篩選體系，目前應(yīng)用最為廣泛的正向篩選體系是磷酸甘露糖異構(gòu)酶系統(tǒng)(PMI)。正向篩選系統(tǒng)不僅可以降低環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，而且可以避免使用酚類物質(zhì)，從而有助于提高轉(zhuǎn)化率[20-22]。在正向篩選系統(tǒng)中，以能編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶的manA基因?yàn)楹Y選基因，它能將6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，使本來不能被植物利用的甘露糖能夠轉(zhuǎn)化為植株所能利用的物質(zhì)。當(dāng)以甘露糖作為篩選劑時(shí)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠以甘露糖作為碳源正常生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化細(xì)胞則由于沒有可以利用的碳源停止生長(zhǎng)[23]。

報(bào)告基因常被用來指示遺傳轉(zhuǎn)化的目的基因是否得到表達(dá)，然而，利用GUS作為一個(gè)報(bào)告系統(tǒng)的最大缺點(diǎn)是它需要一個(gè)破壞性的試驗(yàn)，妨礙了所鑒定的轉(zhuǎn)化組織的進(jìn)一步增殖和再生[24]。在轉(zhuǎn)基因植株的早期檢測(cè)過程中，GFP系統(tǒng)要優(yōu)于GUS系統(tǒng)[15]。此外，Wu等也將DsRed(編碼紅色熒光蛋白)和YFP(編碼黃色熒光蛋白)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高粱轉(zhuǎn)化研究中[15]。

5 農(nóng)桿菌菌株的選擇及轉(zhuǎn)基因品種改良

通常用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株有農(nóng)桿堿型(琥珀堿型)、胭脂堿型、章魚堿型3大類，其代表菌株分別為EHA101/EHA105、C58、LBA4404[21]。已報(bào)道的成功用于單子葉植物的菌株主要有LBA4404、C58、EHA101、EHA105、AGL0和AGL1[22]。從表1中可以看出，在甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化體系中，最常用的菌種有EHA和LBA4404菌株。Pandey研究表明，EHA105比LBA4404和AGL1的瞬時(shí)表達(dá)率高，農(nóng)桿菌EHA105對(duì)植物基因型依賴性較小，能有較高的GFP瞬時(shí)表達(dá)率[14]。而Wu等研究表明，AGL1與LBA4404相比，能夠獲得更高的轉(zhuǎn)化效率，但LBA4404完整的單拷貝插入而沒有質(zhì)粒骨架的比例為96.4%，而AGL1為73.9%[15]。

近年來，科學(xué)家們通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法將不同來源、不同功能的基因?qū)胩鸶吡唬晒Λ@得了一批抗蟲、抗病、抗逆，抗除草劑的多產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)甜高粱品種，為新能源的開發(fā)利用作出了重大貢獻(xiàn)。甜高粱所含人體所必需的氨基酸尤其是賴氨酸含量極低，容易引起兒童營養(yǎng)不良。Zhao等將富賴氨酸HT12基因轉(zhuǎn)入甜高粱品種P898012和PHI391中，并成功獲得含賴氨酸的高粱[28]。Lu等則將賴氨酸t(yī)RNA合成酶基因轉(zhuǎn)入甜高粱品種P898012中，并提高了籽粒中賴氨酸的含量[10]。這些研究成果為世界尤其是非洲、亞洲地區(qū)以甜高粱為主食的國家?guī)砹烁Ｒ簟?/p>

病蟲害是影響作物提高產(chǎn)量和產(chǎn)率的關(guān)鍵因素，Savarimuthu等將能夠編碼殺蟲蛋白的基因轉(zhuǎn)入甜高粱中，可達(dá)到不使用除草劑就能殺死病蟲的目的[24]。近年來，科學(xué)家們將殺蟲晶體蛋白基因cry1Ab、Cry1C轉(zhuǎn)入甜高粱中，在抗玉米螟和大螟方面取得了巨大進(jìn)展[24，29-31]。在抗旱性研究方面，Gao等[5]和Yellisetty等[9]分別將編碼索馬甜蛋白的目的基因tlp和編碼海藻糖-6-磷酸的TSP基因轉(zhuǎn)入甜高粱中，獲得了抗旱的甜高粱新品種。

6 展望

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化法具有較高的轉(zhuǎn)化效率，能夠以單拷貝或者2～3拷貝穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到植物基因組中，并且能夠穩(wěn)定地遺傳給后代[5-6，15，29，32]。盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但仍然面臨一些亟待解決的問題：(1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)甜高粱的基因型及外植體類型要求較高；(2)酚類物質(zhì)的產(chǎn)生對(duì)甜高粱外植體的毒害作用，不利于植株的再生；(3)缺乏較為成熟穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系；(4)重要農(nóng)藝性狀基因方面的研究緩慢，且轉(zhuǎn)基因甜高粱的田間種植及推廣還存在阻礙。至今尚未有甜高粱轉(zhuǎn)基因植株的田間種植的正式報(bào)道。

今后對(duì)甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化的研究可以集中在以下幾個(gè)方面：(1)對(duì)轉(zhuǎn)化體系中的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，如外植體的類型、農(nóng)桿菌菌株、共培養(yǎng)時(shí)間及篩選體系的優(yōu)化等；(2)提高甜高粱的多抗性和營養(yǎng)品質(zhì)改良，研究可以在后代分離標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因體系，提高轉(zhuǎn)基因植物的安全性；(3)發(fā)展應(yīng)用分子標(biāo)記、基因工程及分子設(shè)計(jì)等新元件和新技術(shù)，并與常規(guī)育種有機(jī)結(jié)合，加速新種質(zhì)和品種的培育[26]；(4)利用特殊的地理位置，在一些沿海灘涂及鹽堿地規(guī)范化種植甜高粱品種，為甜高粱的應(yīng)用推廣打下基礎(chǔ)。

[1]Raghuwanshi A，Birch R G. Genetic transformation of sweet sorghum[J]. Plant Cell Reports，2010，29(9)：997-1005.

[2]Zheng L Y，Guo X S，He B，et al. Genome-wide patterns of genetic variation in sweet and grain sorghum (Sorghumbicolor)[J]. Genome Biology，2011，12(11)：R114.

[3]Li M，F(xiàn)eng S，Wu L，et al. Sugar-rich sweet sorghum is distinctively affected by wall polymer features for biomass digestibility and ethanol fermentation in bagasse[J]. Bioresource Technology，2014，167(3)：14-23.

[4]Olweny C，Jamoza J，Dida M M，et al. High genetic diversity for improvement of sweet sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench] genotypes for sugar and allied products[J]. Molecular Plant Breeding，2014，5(6)：29-35.

[5]Gao Z，Jayaraj J，Muthukrishnan S，et al. Efficient genetic transformation ofSorghumusing a visual screening marker[J]. Genome，2005，48(2)：321-333.

[6]Zhao Z Y，Cai T，Tagliani L，et al. Agrobacterium-mediated sorghum transformation[J]. Plant Molecular Biology，2000，44(6)：789-798.

[7]Lu L，Wu X R，Yin X Y，et al. Development of marker-free transgenic sorghum[Sorghumbicolor(L.) Moench]using standard binary vectors with bar as a selectable marker[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2009，99(1)：97-108.

[8]Nguyen T V，Thanh Thu T，Claeys M，et al. Agrobacterium-mediated transformation of sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench] using an improved in vitro regeneration system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2007，91(2)：155-164.

[9]Gurel S，Gurel E，Kaur R，et al. Efficient，reproducibleAgrobacterium-mediated transformation of sorghum using heat treatment of immature embryos[J]. Plant Cell Reports，2009，28(3)：429-444.

[10]Carvalho C H S，Zehr U B，Gunaratna N S，et al. Agrobacterium-mediated transformation of sorghum：factors that affect transformation efficiency[J]. Genetics and Molecular Biology，2004，27(2)：259-269.

[11]劉宣雨，劉樹君，宋松泉. 建立甜高粱(Sorghumbicolor)高頻、高效再生體系的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(23)：4963-4969.

[12]Yellisetty V，Reddy L A，Mandapaka M. In planta transformation of sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench] usingTPS1 gene for enhancing tolerance to abiotic stresses[J]. Journal of Genetics，2015，94(3)：425-434.

[13]Elkonin I A，Lopushanskaya R F，Pakhomova N V. Initiation and maintenance of friable，embryogenic callus of sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench] by amino acids[J]. Maydica，1995，40：153-157.

[14]Pandey A K，Bhat B，Balakrishna D，et al. Genetic transformation of sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench.][J]. International Journal of Biotechnology and Biochemistry，2010，6(1)：45-53.

[15]Wu E，Lenderts B，Glassman K，et al. OptimizedAgrobacterium-mediated Sorghum transformation protocol and molecular data of transgenic sorghum plants[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2013，50(1)：9-18.

[16]Jambagi S，Bhat R S，Bhat S，et al. Agrobacterium-mediated transformation studies in sorghum using an improvedgfpreporter gene[J]. SAT Agricultural Research，2010，8：1-5.

[17]Umamaheswari S. Agrobacterium mediated transformation of sorghum bicolor for disease resistance[J]. International Journal of Pharma and bio Sciences，2010，1(4)：272-281.

[18]Jeoung J，Krishnaveni S，Muthukrishnan S. Optimization of sorghum transformation parameters using genes for green fluorescent protein andβ-glucuronidase as visual markers[J]. Hereditas，2002，137(1)：20-28.

[19]Khanna H K，Daggard G E. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of wheat using a superbinary vector and a polyamine-supplemented regeneration medium[J]. Plant Cell Reports，2003，21(5)：429-436.

[20]Gao Z，Xie X，Ling Y，et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated sorghum transformation using a mannose selection system[J]. Plant Biotechnology Journal，2005，3(6)：591-599.

[21]Gurel S，Gurel E，Miller T I，et al. Agrobacterium-mediated transformation ofSorghumbicolorusing immature embryos[J]. Methods in Molecular Biology，2012，847(10)：109-122.

[22]Urriola J，Rathore K S. Temporal and spatial activities of a rice glutelin promoter in transgenic sorghum[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2014，116(2)：227-234.

[23]Joersbo M. Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes[J]. Physiologia Plantarum，2001，111(3)：269-272.

[24]Girijashankar V，Swathisree V. Genetic transformation of Sorghum bicolor[J]. Physiology and Molecular Biology of Plants：an International Journal of Functional Plant Biology，2009，15(4)：287-302.

[25]Ellar D. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action ofBacillusthuringiensisδ-endotoxins with different insect specificity[J]. Biochimica et Biophysica acta，1987，924(3)：509-518.

[26]劉宣雨，王青云，劉樹君，等. 高粱遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào)，2011，46(2)：216-223.

[27]Lowe B. Factors influencingAgrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2004，40(1)：31-45.

[28]Zhao Z，Glassman K，Sewalt V. Nutritionally improved transgenic sorghum[C]// Vasil I K. Plant Biotechnology 2002 and Beyond，F(xiàn)lorida：Kluwer Academic Publishers，2003：413-416.

[29]Alan P. Development of transgenicSorghumbicolor(L.) Moench resistant to theChilopartellus(Swinhoe) throughAgrobacterium-mediated transformation[J]. Molecular Biology and Genetic Engineering，2014，2(1)：1-8.

[30]張明洲，唐 喬，陳宗倫，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)Bt基因遺傳轉(zhuǎn)化高粱[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2009，25(3)：418-423.

[31]朱 莉，郎志宏，李桂英，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜高梁轉(zhuǎn)Btcry1Ah的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(10)：1989-1996.

[32]Howe A，Sato S，Dweikat I，et al. Rapid and reproducibleAgrobacterium-mediated transformation of sorghum[J]. Plant Cell Reports，2006，25(8)：784-791.

[33]劉公社，周慶源，宋松泉，等. 能源植物甜高粱種質(zhì)資源和分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào)，2009，44(3)：253-261.