方珍珍,段霽航,程鎮(zhèn)燕,孫金輝,白東清,喬秀亭

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

丙酮酸羧激酶(PK)屬于丙酮酸激酶超家族的一員，它是糖酵解過(guò)程中第三個(gè)限速酶，即催化糖酵解最后一步的關(guān)鍵酶：在鉀離子和鎂離子參與下，丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸和二磷酸腺苷轉(zhuǎn)化成丙酮酸和三磷酸腺苷。此反應(yīng)在生理?xiàng)l件下是不可逆的，其產(chǎn)物丙酮酸可參與多種代謝途徑，因此丙酮酸羧激酶在許多需要丙酮酸參與的代謝途徑中的作用非常重要。

近年，各種提高魚(yú)類生長(zhǎng)率的方法逐步發(fā)展起來(lái)[1-2]。因此，研究者們轉(zhuǎn)而研究與肌肉生長(zhǎng)有關(guān)的基因。Johansen等[3]在對(duì)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)禁食中觀察到它與肌肉生長(zhǎng)有關(guān)的基因表達(dá)量大量降低。Ohta等[4]在禁食的魚(yú)體中發(fā)現(xiàn)，某些與三磷酸腺苷代謝相關(guān)的基因表達(dá)量和與肌肉發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)量?jī)烧咭黄鹛岣?，但是前者有更為顯著的提高，此現(xiàn)象說(shuō)明饑餓等生理狀態(tài)會(huì)造成三磷酸腺苷代謝信號(hào)通路和肌肉發(fā)育的信號(hào)通路更為敏感，但前者比后者更為敏感。丙酮酸激酶能夠使磷酸烯醇式丙酮酸和二磷酸腺苷反應(yīng)產(chǎn)生三磷酸腺苷，所以為了調(diào)節(jié)魚(yú)類生長(zhǎng)，研究丙酮酸激酶基因表達(dá)變化的意義重大。

烏克蘭鱗鯉(Cyprinuscarpoio)屬于鯉形目、鯉科、鯉亞科、鯉屬，是經(jīng)過(guò)綜合科學(xué)選育而成的優(yōu)良品種，已經(jīng)在莫斯科地區(qū)的漁場(chǎng)進(jìn)行大量養(yǎng)殖。1998年全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站從俄羅斯引進(jìn)，國(guó)家級(jí)天津市換新水產(chǎn)良種場(chǎng)經(jīng)強(qiáng)化培育和選種，生長(zhǎng)較快，具有豐富的遺傳多樣性。2005年經(jīng)全國(guó)水產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)審定，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)在全國(guó)推廣養(yǎng)殖。該品種已在天津、河北、遼寧、黑龍江等省部分地區(qū)進(jìn)行了生產(chǎn)性對(duì)比養(yǎng)殖試驗(yàn),增產(chǎn)效果顯著。目前針對(duì)烏克蘭鱗鯉營(yíng)養(yǎng)與飼料方面，高妍等[5]研究了不同水平白藜蘆醇對(duì)烏克蘭鱗鯉消化酶及非特異性免疫指標(biāo)的影響，梁愛(ài)軍等[6]利用水平式淀粉凝膠電泳法對(duì)46尾烏克蘭鱗鯉進(jìn)行了AAT、α-GPD、GPI、IDH、MDH和PGM共6種同工酶以及肌漿蛋白進(jìn)行了電泳分析；但是在分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)方向，針對(duì)烏克蘭鱗鯉的研究當(dāng)前尚是空白。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)

健康試驗(yàn)魚(yú)取自天津市換新水產(chǎn)良種場(chǎng)同一批繁殖的魚(yú)種，平均體質(zhì)量(20±2) g，平均體長(zhǎng)為10 cm，隨后運(yùn)往天津農(nóng)學(xué)院。進(jìn)行消毒處理后在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行暫養(yǎng)，試驗(yàn)期間水溫控制在(30±2) ℃，溶氧量>6 mg/L，pH為7.2，氨氮<0.5 mg/L，養(yǎng)殖箱24 h連續(xù)曝氣，日投喂2次，日換水1/3～1/2，用虹吸法吸去排泄物。

每日9：00分別向兩箱魚(yú)種投喂低糖飼料，使其適應(yīng)7 d，然后禁食1 d，次日9：00分別投喂低糖、高糖飼料，15：00開(kāi)始取樣。將烏克蘭鱗鯉肝胰臟、腦、腎臟、心臟、肌肉取出，提取RNA。

低糖飼料各原料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：魚(yú)粉8%，豆粕15%，花生粕16%，棉粕8%，菜粕10%，干酒糟高蛋白3%，豆油4%，預(yù)混料1%，微晶纖維素25%，麩皮10%，糊精0。

高糖飼料各原料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：魚(yú)粉8%，豆粕15%，花生粕16%，棉粕8%，菜粕10%，干酒糟高蛋白3%，豆油4%，預(yù)混料1%，微晶纖維素0，麩皮10%，糊精25%。

1.2 試劑

RNAisoPlus、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit、3’-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase、TaKaRa LA Taq購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；pGEM-T克隆載體購(gòu)自普洛麥格生物技術(shù)(北京)有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由本校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。試驗(yàn)所用引物均由蘇州金唯智生物科技(北京)有限公司合成。

1.3 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因全長(zhǎng)序列的克隆

取禁食后烏克蘭鱗鯉肝胰臟組織，采用Trizol-酚-氯仿法提取肝胰臟總RNA，檢索已知魚(yú)類的丙酮酸羧激酶的基因序列，在該序列的中間位置的保守區(qū)應(yīng)用相同原理設(shè)計(jì)一對(duì)具有簡(jiǎn)并性的上、下游引物。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

切膠回收目的片段后連接到pGEM-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后送蘇州金唯智生物科技(北京)有限公司測(cè)序。

根據(jù)測(cè)序驗(yàn)證后的部分序列設(shè)計(jì)RACE引物，擴(kuò)增丙酮酸羧激酶的cDNA的5′和3′末端。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 30 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。切膠回收目的片段后連接到pGEM-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求5′末端挑取8個(gè)陽(yáng)性克隆，3′端挑取5個(gè)陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后送蘇州金唯智生物科技(北京)有限公司測(cè)序。本試驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物

1.4 序列分析

使用DNAStar軟件中的EditSeq程序?qū)蹩颂m鱗鯉丙酮酸羧激酶基因中間序列、3′端序列和5′端序列的核苷酸數(shù)據(jù)使用軟件將其按順序拼接起來(lái)，得到烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因全長(zhǎng)cDNA序列。使用DNAStar軟件中的EditSeq程序進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的查詢，并對(duì)基因進(jìn)行翻譯，同時(shí)對(duì)蛋白等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast工具進(jìn)行同源性序列搜索，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Conserved Domain Search上完成活性位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。

1.5 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因在各組織中表達(dá)

取低糖組、高糖組烏克蘭鱗鯉活體解剖，快速分離肝臟、腦、腎臟、心臟、肌肉和腸等組織，分別提取總RNA，1%變性瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性。用PK-F與PK-R為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)以β-actin為內(nèi)標(biāo)，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏克蘭鱗鯉肝胰臟總RNA的制備

肝胰臟總RNA的制備按照TaKaRa RNAisoPlus試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，可以看到RNA亮度高，28S條帶的亮度約為18S條帶亮度的2倍(圖1)，并且條帶清晰，說(shuō)明本試驗(yàn)制備的RNA質(zhì)量合格，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因的克隆

以烏克蘭鱗鯉正常的肝胰臟組織提取的RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA為模板，以PK-F1和PK-R1為引物，PCR得到約800 bp的中間序列(圖2)，克隆測(cè)序后得822 bp的丙酮酸羧激酶的基因序列，以得到的序列片段為模板設(shè)計(jì)3′端引物PK-3′ F，得到約1000 bp的3′端序列(圖3)，克隆測(cè)序后為902 bp，并根據(jù)中間序列為模板設(shè)計(jì)5′端引物PK-5′R，PK-5′NR，PCR得到約500 bp的5′端序列(圖4)，克隆測(cè)序后為514 bp。經(jīng)拼接后得烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因全長(zhǎng)序列，其總長(zhǎng)為1913 bp，其中開(kāi)放閱讀框1617 bp，翻譯539個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為58.72 ku，等電點(diǎn)為6.57，3′非翻譯區(qū)長(zhǎng)154 bp及多聚腺苷酸尾巴，5′非翻譯區(qū)長(zhǎng)143 bp。

圖1 烏克蘭鱗鯉肝胰臟組織總RNA1%瓊脂糖凝膠電泳M為DL2000 DNAmarker；1為總RNA.

圖2 丙酮酸羧激酶中間片段PCR結(jié)果M為DL2000 DNAMarker；1為目的片段.

圖3 PK5’端和3’端PCR結(jié)果M為DL5000 DNAMarker；1為目的片段.

2.3 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因的核苷酸組成及推導(dǎo)的氨基酸序列

將各片段的測(cè)序結(jié)果拼接后，得到烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因全長(zhǎng)序列(圖5)，接下來(lái)推導(dǎo)出它的氨基酸序列(圖6)。

本試驗(yàn)自烏克蘭鱗鯉肝胰臟中分離到了丙酮酸羧激酶基因的cDNA全序列，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1617 bp，共翻譯538個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為58.72 ku，等電點(diǎn)為6.57。

其中，其氨基酸序列有活性位點(diǎn)1個(gè)，其范圍包括Arg79和Asn81、Asp119、Phe251、Lys277和Glu279、Asp303、Thr335；其結(jié)構(gòu)域邊界包括Asn51和Thr52，Pro113，Ala115，Pro123至Arg126，Val215和Asn216，Val223，Pro226至Asp230，Asp245，Arg253，Ala260，Asn271，Glu307，Asn325和Ser326，Pro330，Gly362，Asp364，Glu393，Ala395和lle396，Arg450，Arg452，Arg454，Gln465，Arg468和Gln469，Gln471，Gln473，Leu475至Gly477。

由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集了斑馬魚(yú)(Daniorerio)和草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)等6種生物丙酮酸羧激酶的氨基酸序列，使用DNAStar中的MegAlign 工具，用Clustal W方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)烏克蘭鱗鯉與草魚(yú)的親緣關(guān)系最接近，其次為斑馬魚(yú)和綠河鲀(Tetraodonnigroviridis)(圖7)。

2.4 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因各組織的表達(dá)

采用半定量RT-PCR方法對(duì)丙酮酸羧激酶基因在肝胰臟、腦、腎臟、心臟、肌肉、腸道等組織的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，低糖組丙酮酸羧激酶基因在各組織中均有表達(dá)，在肝胰臟、腦和心臟中表達(dá)較豐富；高糖組丙酮酸羧激酶基因在肝胰臟、腦、腎臟和腸道中有明顯表達(dá)，其中在肝胰臟和腦中的表達(dá)量較豐富，在心臟和肌肉中的表達(dá)很微弱(圖8～圖10)。

圖4 丙酮酸羧激酶的核苷酸序列右邊數(shù)字代表核苷酸編號(hào)；閱讀框1617 bp，用三聯(lián)碼表示；加尾信號(hào)用紅色邊框表示.

圖5 丙酮酸羧激酶所編碼的氨基酸序列

圖6 丙酮酸羧激酶的各結(jié)合位點(diǎn)

圖7 烏克蘭鱗鯉與部分已知物種的丙酮酸羧激酶系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖8 低糖組和高糖組半定量PCR結(jié)果

圖9 低糖組各組織PK表達(dá)情況

圖10 高糖組各組織PK表達(dá)情況

3 討 論

3.1 烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因的序列分析

烏克蘭鱗鯉丙酮酸羧激酶基因的核苷酸序列5′端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度為142 bp，草魚(yú)(JQ951928.1)為1 bp，斑馬魚(yú)(NM201289.1)為32 bp；該酶的3′端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度為154 bp，草魚(yú)為180 bp，斑馬魚(yú)為158 bp。

由于在脊椎動(dòng)物中，丙酮酸羧激酶的同工酶分為四種，分別為M1型、M2型、L型、R型[7-8]。M1型分布于心肌、骨骼肌和腦組織；M2型分布于腦及肝臟等組織[9]。本試驗(yàn)所得的丙酮酸羧激酶基因是從烏克蘭鱗鯉肝胰臟中克隆的，因此，可以推斷出該酶可能屬于M2型同工酶。

丙酮酸羧激酶的作用催化磷酸烯醇式丙酮酸和二磷酸腺苷轉(zhuǎn)化成丙酮酸和三磷酸腺苷，該反應(yīng)是放能反應(yīng)。由圖6可見(jiàn)，該酶沒(méi)有三磷酸腺苷結(jié)合位點(diǎn)，這印證了該酶在行使其催化功能時(shí)不需要三磷酸腺苷的水解供應(yīng)其能量。

烏克蘭鱗鯉與草魚(yú)、斑馬魚(yú)和綠河鲀?cè)撁傅陌被嵝蛄性诜肿咏Y(jié)構(gòu)上均包含1個(gè)活性位點(diǎn)和1個(gè)結(jié)構(gòu)域邊界，各自氨基酸序列上的位置基本一致。

3.2 丙酮酸羧激酶基因組織表達(dá)

由圖9～圖10可見(jiàn)，烏克蘭鱗鯉在禁食48 h后，其各組織丙酮酸羧激酶基因的表達(dá)水平。丙酮酸羧激酶除在肝胰臟和腎臟中表達(dá)水平較高外，還在腸道中表達(dá)得較為活躍。這與Pilkis等[10]的研究結(jié)果不同，他們發(fā)現(xiàn)在饑餓狀態(tài)下，丙酮酸羧激酶的表達(dá)量下降。這個(gè)結(jié)果表明，烏克蘭鱗鯉在饑餓的情況下，機(jī)體糖異生所產(chǎn)生的少量丙酮酸會(huì)立即進(jìn)入糖酵解過(guò)程，轉(zhuǎn)化為能量供給魚(yú)類的生理活動(dòng)。烏克蘭鱗鯉在進(jìn)食碳水化合物含量較低的飼料6 h后，其各組織的丙酮酸羧激酶基因的表達(dá)水平。丙酮酸羧激酶基因在各組織中均有表達(dá)，在肝臟、腦、心臟中表達(dá)較豐富，以肝胰臟最多，這與肖玲[11]對(duì)松江鱸(Trachidermusfasciatus)丙酮酸羧激酶基因的研究結(jié)果基本一致，與Chen等[12]對(duì)草魚(yú)丙酮酸羧激酶基因的研究結(jié)果一致，與Panserat等[13]對(duì)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究結(jié)果相同，與Knox等[14]對(duì)鱈魚(yú)(Gadusmorhua)、歐鰈(Pleuronectesplatessa)的研究結(jié)果部分相同，在心臟、腦中含量高，在肝胰臟、腎中相對(duì)較低。糖酵解的相關(guān)基因丙酮酸羧激酶在肝胰臟、腦、腎臟、腸道中有表達(dá)，這也從一個(gè)側(cè)面說(shuō)明當(dāng)時(shí)烏克蘭鱗鯉的血糖水平相對(duì)較高。

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