穆富香，楊代宇，白飛妮，汪 瑩，楊海波，于 媛，詹世平

(大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622)

溫室效應(yīng)是21世紀(jì)人類面臨的最嚴(yán)峻的環(huán)境危機(jī)之一，人類燃燒化石燃料所產(chǎn)生的CO2是引起全球溫室效應(yīng)的最主要物質(zhì)[1]。目前，全球每年排放CO2超過2.5×1010t，中國(guó)已達(dá)6×109t，居世界第一位[2]，因此，研究CO2的轉(zhuǎn)化和利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

鹽藻(Dunaliellasalina)光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)范圍廣，細(xì)胞內(nèi)不僅含有包括人體必需8種氨基酸在內(nèi)的18種氨基酸，同時(shí)含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖以及較多的Ca、P、Zn等礦物質(zhì)。在適當(dāng)條件下，累積油脂可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的40%～50%，合成的β-胡蘿卜素可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的10%，因此，鹽藻不僅用作魚、蝦、貝等幼體的餌料，而且在食品、醫(yī)療保健、液體燃料、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[3-4]。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

試驗(yàn)所用鹽藻藻種為大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院海洋微藻課題組保存的藻種。

1.2 儀器和藥品

EL204電子天平[梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司]，80-2離心沉淀機(jī)(上海榮泰生化工程有限公司)，LD5-2A臺(tái)式離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，HH-S恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)，pHS-2C型精密酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，WY100Y手持式鹽度計(jì)[麥科儀(北京)科技有限公司]等；無(wú)水乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，巴比妥(上海篤瑪生物科技有限公司),巴比妥鈉(上海篤瑪生物科技有限公司)，均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微藻培養(yǎng)及CO2通入

取5 L錐形瓶，分別加入2700 mL滅菌海水(加入氯化鈉調(diào)節(jié)鹽度為65，pH 8.10)和900 mL處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鹽藻藻液(A650nm=0.106)，按1‰的比例加入2.7 mL的康維方營(yíng)養(yǎng)液[8]。在25 ℃、1800 lx、光暗比為12∶12的條件下培養(yǎng)鹽藻。每天光照階段開始和光照階段結(jié)束時(shí)各搖瓶1次。

根據(jù)亨利定律，25 ℃時(shí)CO2在純水中的溶解度為1.24×10-5mol/L，pH 5.67[9]。為研究海水中CO2溶解度最大時(shí)鹽藻生長(zhǎng)及碳酸酐酶活性變化趨勢(shì)，以此為依據(jù)每天在光照階段開始前向鹽藻培養(yǎng)體系中通入CO2至pH恒定不變(測(cè)得此時(shí)pH 6.00，表明CO2飽和)。

試驗(yàn)開始時(shí)，每天在光照階段開始前向鹽藻培養(yǎng)液中通入CO2至pH 6.00，開始12 h光照，再繼續(xù)12 h黑暗，直至培養(yǎng)結(jié)束。以未加CO2的滅菌海水中接種的鹽藻培養(yǎng)液為對(duì)照。每組試驗(yàn)培養(yǎng)3個(gè)平行樣。

1.3.2 測(cè)定指標(biāo)

為探究鹽藻對(duì)CO2的利用程度及其對(duì)鹽藻生長(zhǎng)和碳酸酐酶活性的影響，每天分別在光照階段結(jié)束時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)液pH、吸光度、鹽藻細(xì)胞葉綠素含量和碳酸酐酶活性；在黑暗階段結(jié)束時(shí)取樣測(cè)定pH和吸光度。

pH測(cè)定：每次取培養(yǎng)藻液30 mL，用pHS-2C型精密酸度計(jì)測(cè)定pH值。平行3次。

生物量測(cè)定：試驗(yàn)開始前，先用UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定鹽藻培養(yǎng)液的最大吸收波長(zhǎng)為650 nm。試驗(yàn)過程中，每次取培養(yǎng)藻液10 mL，于650 nm波長(zhǎng)測(cè)定藻液的吸光值，以間接反映鹽藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。平行測(cè)定3次。

葉綠素含量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[10]的方法，每日取光照階段結(jié)束時(shí)的鹽藻培養(yǎng)液500 mL，3000 r/min離心3 min，棄上清液，收集藻泥，分成3份，1份用于測(cè)定葉綠素，另外2份用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)、外的碳酸酐酶活性。將用于測(cè)定葉綠素的藻泥用去離子水清洗3次后按質(zhì)量平均分成3份，用85%的乙醇提取葉綠素，并測(cè)定提取液在波長(zhǎng)649 nm和665 nm處的吸光度值。按照公式(1)、(2)分別計(jì)算待測(cè)液中葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量濃度，按照公式(3)計(jì)算鹽藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素含量。

Ca=13.95A665-6.88A649

(1)

Cb=24.96A649-7.32A665

(2)

式中，Ca、Cb分別為待測(cè)液中葉綠素a、葉綠素b的質(zhì)量濃度(mg/L)，A649、A665分別為649 nm、665 nm處的吸光度值。

葉綠素含量(濕質(zhì)量)/mg·g-1=CV/m

(3)

式中，C為葉綠素質(zhì)量濃度(mg/L)，V為藻液體積(L)，m為藻泥濕質(zhì)量(g)。

細(xì)胞內(nèi)外碳酸酐酶活性的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[11]測(cè)定碳酸酐酶活性。取上述操作中獲得的另外2份藻泥，首先將其中的1份按質(zhì)量平均分成3份，立即懸浮于pH為8.30的12 mL巴比妥—巴比妥鈉緩沖溶液中，再加入6 mL在4 ℃冷藏的CO2飽和蒸餾水，用pH計(jì)測(cè)量反應(yīng)體系中pH的變化，記錄pH從8.30降至7.30時(shí)所用的時(shí)間，測(cè)定細(xì)胞外碳酸酐酶活性。將另外一份藻泥凍融3次破碎細(xì)胞后，再按質(zhì)量平均分成3份，重復(fù)胞外碳酸酐酶測(cè)定過程，用于測(cè)定細(xì)胞總的碳酸酐酶活性。按照下式計(jì)算碳酸酐酶比活性。

碳酸酐酶比活性(濕質(zhì)量)/EU·g-1=10×(t0/t1-1)/m

(4)

式中，t0為反應(yīng)體系未加藻泥時(shí)pH下降所用的時(shí)間(min)，t1是反應(yīng)體系中加入藻泥后pH下降所用的時(shí)間(min)，m為藻泥濕質(zhì)量(g)。

細(xì)胞內(nèi)碳酸酐酶比活性(濕質(zhì)量)/EU·g-1=細(xì)胞總碳酸酐酶比活性-細(xì)胞外碳酸酐酶比活性

(5)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計(jì)、處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行Duncan多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 外加CO2對(duì)鹽藻培養(yǎng)體系pH的影響

按照1.3.1，在滅菌海水中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鹽藻藻液(A650 nm=0.106)，分別測(cè)定光照階段結(jié)束和黑暗階段結(jié)束時(shí)培養(yǎng)液的pH，并與未通入CO2的對(duì)照組比較，結(jié)果見表1。

由表1可見，未通入CO2的對(duì)照組鹽藻培養(yǎng)液，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，光照階段結(jié)束時(shí)和黑暗階段結(jié)束時(shí)的pH均在8.10～8.20，說明鹽藻通過光合作用吸收的CO2和通過呼吸作用釋放的CO2基本處于平衡狀態(tài)。而每天光照階段開始前通入CO2至pH 6.00的鹽藻培養(yǎng)液，第1 d光照階段結(jié)束時(shí)的pH為6.26，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，pH緩慢增大。培養(yǎng)3 d后，pH顯著增加(P<0.05)，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)pH約7.04。黑暗階段結(jié)束時(shí)培養(yǎng)液的pH變化與光照階段結(jié)束時(shí)的pH變化趨勢(shì)基本一致，且同一天內(nèi)黑暗階段結(jié)束時(shí)的pH比光照階段結(jié)束時(shí)的pH稍有增加。

表1 外加CO2對(duì)鹽藻培養(yǎng)體系pH的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

注：各組數(shù)據(jù)之間，同一字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母間表示差異顯著(P<0.05).

光合作用包括光反應(yīng)和暗反應(yīng)兩個(gè)過程。前者是在葉綠素類囊體膜上高效吸收和傳遞光能，并將其轉(zhuǎn)化為生物能和還原勢(shì)能；后者是利用光反應(yīng)轉(zhuǎn)化的生物能及還原勢(shì)能固定CO2，并產(chǎn)生碳水化合物[12]。光反應(yīng)必須在光照條件下進(jìn)行，暗反應(yīng)是否有光均可進(jìn)行。

在前3 d培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，生物量增加少，光反應(yīng)較弱，轉(zhuǎn)化的生物能和還原勢(shì)能少，導(dǎo)致暗反應(yīng)對(duì)CO2的利用少，故培養(yǎng)液的pH上升得少。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽藻生物量逐漸增多，光反應(yīng)增強(qiáng)，為暗反應(yīng)提供了更多的生物能和還原勢(shì)能，使其對(duì)CO2的利用增強(qiáng)，進(jìn)而pH增加明顯。

由于光合作用的限速步驟是暗反應(yīng)過程的固碳反應(yīng)，光反應(yīng)過程通過快速反應(yīng)獲得生物能和還原勢(shì)能，而暗反應(yīng)過程通過相對(duì)的慢速反應(yīng)固定CO2并釋放生物能。因此，在黑暗過程中CO2被繼續(xù)吸收和轉(zhuǎn)化，使培養(yǎng)液的pH繼續(xù)有所升高。

2.2 外加CO2對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的影響

碳是構(gòu)成微藻細(xì)胞組分的重要元素，試驗(yàn)中培養(yǎng)鹽藻所用的康維方營(yíng)養(yǎng)液中不含有碳元素，鹽藻通過光合作用的暗反應(yīng)過程利用外環(huán)境提供的CO2轉(zhuǎn)化為碳水化合物，促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖。外加CO2至pH 6.00達(dá)到飽和時(shí)鹽藻培養(yǎng)液的吸光度值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)見圖1。

圖1 外加CO2對(duì)鹽藻生長(zhǎng)的影響

由圖1可見，在通入CO2培養(yǎng)的第1 d內(nèi)，鹽藻細(xì)胞處于適應(yīng)階段，吸光度基本沒有增加；2～5 d，培養(yǎng)液的吸光度基本上均呈直線上升，表明鹽藻細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。未通入CO2時(shí)，在培養(yǎng)的前2 d，鹽藻細(xì)胞處于適應(yīng)階段，吸光度基本沒有增加，3～5 d，培養(yǎng)液的吸光度基本上均呈直線上升，鹽藻細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。培養(yǎng)至第6 d時(shí)，兩種體系的鹽藻培養(yǎng)液均進(jìn)入穩(wěn)定期，但通入CO2的吸光度值顯著高于未通入CO2的吸光度值。

培養(yǎng)1 d后，后一天光照階段結(jié)束時(shí)的吸光度值顯著高于前一天光照階段結(jié)束時(shí)的吸光度值，而同一天黑暗階段(比光照階段推遲12 h)結(jié)束時(shí)的吸光度值僅比光照階段結(jié)束時(shí)的吸光度值略有增加，表明鹽藻主要在光照階段通過光合作用的暗反應(yīng)將CO2固定并轉(zhuǎn)化為細(xì)胞組分，促進(jìn)細(xì)胞分裂和繁殖，增加生物量。這一變化過程與表1中光照階段結(jié)束和黑暗階段結(jié)束時(shí)的pH變化趨勢(shì)相一致。

2.3 外加CO2對(duì)鹽藻葉綠素含量的影響

葉綠素是光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收中起核心作用，其含量高低一方面反映微藻光合作用能力的強(qiáng)弱，另一方面可以用來估算浮游植物的生物量[13]。鹽藻中主要含有葉綠素a和葉綠素b[10]，試驗(yàn)中測(cè)定其含量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化，結(jié)果見圖2。

由圖2可見，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，通入CO2和未通入CO2的培養(yǎng)體系中鹽藻細(xì)胞的葉綠素含量均逐漸增加，但通入CO2的鹽藻細(xì)胞中的葉綠素a和葉綠素b含量分別顯著高于未通入CO2的對(duì)照組的葉綠素a、b的含量。這與圖1中吸光度增加的趨勢(shì)一致。表明CO2的通入，能夠促進(jìn)鹽藻細(xì)胞產(chǎn)生更多的葉綠素進(jìn)行光合作用吸收轉(zhuǎn)化CO2，加快細(xì)胞生長(zhǎng)。通入CO2體系和對(duì)照體系在同一培養(yǎng)時(shí)間時(shí)葉綠素a含量顯著大于葉綠素b含量。葉綠素a主要吸收紅光，而葉綠素b主要吸收藍(lán)紫光，說明鹽藻細(xì)胞更傾向于吸收紅光。

圖2 外加CO2對(duì)鹽藻葉綠素含量的影響

2.4 外加 CO2對(duì)鹽藻碳酸酐酶活性的影響

自然海域的海水中CO2濃度約為10 μmol/L[14]，為了適應(yīng)水中低CO2環(huán)境并保持較高的光合作用，藻類自身形成了提高CO2濃度的特有途徑，即藻類的CO2濃縮機(jī)制。碳酸酐酶是CO2濃縮機(jī)制的重要組成部分之一，在藻類光合作用中起著重要作用[15]。除對(duì)照組的胞內(nèi)碳酸酐酶比活性在培養(yǎng)前3 d基本不變、之后顯著增加外，通入CO2體系的胞內(nèi)、外碳酸酐酶比活性和對(duì)照組的胞外碳酸酐酶比活性均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多；同一培養(yǎng)時(shí)間兩體系的胞外碳酸酐酶比活性分別高于各自的胞內(nèi)碳酸酐酶比活性。此外，通入CO2的鹽藻培養(yǎng)液中，細(xì)胞內(nèi)、外的碳酸酐酶比活性均顯著高于未通入CO2的對(duì)照組中相應(yīng)的碳酸酐酶比活性(圖3)。

圖3 外加CO2對(duì)鹽藻碳酸酐酶的影響

由表1可知，未通入CO2的對(duì)照組鹽藻培養(yǎng)液的pH一直為8.10～8.20，而通入CO2的鹽藻培養(yǎng)液，在每天光照階段開始前通入CO2至溶液pH為6.00，光照階段結(jié)束時(shí)的pH隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，從第1 d的6.26逐漸上升至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的7.04。參考碳酸和HCO3-在水溶液中的分布系數(shù)計(jì)算公式(6)～(7)[16]，計(jì)算鹽藻培養(yǎng)液pH在6.00、6.26、7.04、8.20時(shí)碳酸、HCO3-的分布系數(shù)，結(jié)果見表2。

(6)

(7)

式中，Ka1=4.5×10-7，Ka2=4.7×10-11。

表2 不同pH時(shí)碳酸和的分布系數(shù)

3 討 論

CO2是微藻光合自養(yǎng)的唯一碳源，但不同微藻所需的最適CO2含量不同，改變其含量會(huì)影響微藻生長(zhǎng)和細(xì)胞組分的變化[17]。De Morais等[18]發(fā)現(xiàn)，凱氏小球藻(Chlorellakessleri)、斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)、螺旋藻屬(Spirulina)和普通小球藻(C.vulgaris)4種微藻均在CO2含量為6%時(shí)生長(zhǎng)最好；Tang等[19]的研究表明，斜生柵藻在10%的CO2含量下生長(zhǎng)最好。范金鳳等[20]研究結(jié)果顯示，二形柵藻(S.dimorphus)可在10%～20%的CO2含量下生長(zhǎng)，且CO2含量為10%時(shí)二形柵藻生長(zhǎng)最好，此時(shí)pH為6.0～7.0。本試驗(yàn)中外加CO2至飽和時(shí)，鹽藻培養(yǎng)液的pH由最初的6.0升至培養(yǎng)結(jié)束7.0，與范金鳳等[20]通入10% CO2的培養(yǎng)液的pH范圍一致，所得結(jié)果也一致，表明鹽藻能夠利用的CO2含量約為10%。

火電廠煙道氣中的CO2一般為10%～20%[28]，因此在鹽藻培養(yǎng)液中通入CO2至飽和，不僅可轉(zhuǎn)化吸收煙道氣中的CO2，為降低大氣中CO2的含量探究有效的利用途徑，而且能提高鹽藻生長(zhǎng)速率，進(jìn)而產(chǎn)生更多的生物量用在水產(chǎn)餌料、醫(yī)療保健、食品添加劑、精細(xì)化工品和液體燃料等領(lǐng)域。因此，利用鹽藻轉(zhuǎn)化吸收CO2無(wú)論從環(huán)境保護(hù)還是資源利用角度均有重要應(yīng)用價(jià)值。

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