徐雅梅，王傳旗，武俊喜，張文靜，王小川，赤列催珍，徐德飛，包賽很那，苗彥軍*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，北京 100101)

重金屬污染是當(dāng)今面積最廣、危害最大的環(huán)境問(wèn)題之一[1-2]。 雖然有些金屬如Mn、Cu、Zn、Mo等為植物不可缺少的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，但是當(dāng)植物體內(nèi)重金屬過(guò)量或超過(guò)某一臨界值時(shí)，就會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生脅迫作用，導(dǎo)致其體內(nèi)代謝過(guò)程紊亂，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，甚至導(dǎo)致植物枯萎、死亡[3]。以往，由于藏中部地區(qū)金屬礦的開(kāi)采，造成了礦區(qū)土壤與水體重金屬嚴(yán)重污染，使得礦區(qū)及其周邊地區(qū)的生存環(huán)境適宜性降低，生物多樣性下降，生態(tài)系統(tǒng)脆弱性增加[4]。礦區(qū)退化植被恢復(fù)成為生態(tài)恢復(fù)研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)[5]。植物修復(fù)技術(shù)是在不破壞土壤生態(tài)環(huán)境、保持土壤結(jié)構(gòu)和微生物活性的情況下，通過(guò)植物根系及其共存微生物體系直接將大量的重金屬元素吸收，進(jìn)而收獲植物地上部分并將它們無(wú)害化處理，從而達(dá)到治理修復(fù)被污染的土壤的目的[6-9]。

垂穗披堿草(Elymusnutans)為禾本科披堿草屬牧草，又名鉤頭草、彎穗草[10]。原為野生種，在我國(guó)西藏及西北、華北等地區(qū)均有分布，在青藏高原海拔2500～4000 m的高寒濕潤(rùn)地區(qū)為建群種，是有價(jià)值的飼用植物[11]。除具有飼用價(jià)值外，生態(tài)適應(yīng)性廣，具有防風(fēng)固沙、保持水土、抗旱、抗寒、耐鹽堿等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)生態(tài)保護(hù)和生態(tài)恢復(fù)有重要意義[12]。Mn2+、Pb2+脅迫對(duì)西藏地區(qū)野生垂穗披堿草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的研究尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。因此，本研究選擇了西藏海拔較高的巴青縣野生垂穗披堿草為試驗(yàn)材料，探討了重金屬M(fèi)n2+、Pb2+離子對(duì)其種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的生理影響，以期為西藏礦區(qū)退化植被恢復(fù)和土壤重金屬污染的治理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料于2003年9月采自西藏那曲區(qū)巴青縣(31°53′57″ N，93°10′44″ E，海拔4675 m)。之后在西藏農(nóng)牧學(xué)院農(nóng)場(chǎng)(29°39′46″ N，94°21′31″ E，海拔2990 m)經(jīng)過(guò)13年人工選育栽培。試驗(yàn)于2017年4-7月，在西藏高原作物栽培學(xué)與耕作學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)前在室溫條件下做預(yù)試驗(yàn)，測(cè)得供試材料種子千粒重為(4.8±0.05) g，平均發(fā)芽率為91.5%。

1.2 試驗(yàn)方法

選取籽粒飽滿、大小均一的種子，用0.5% KMnO4溶液消毒15 min，然后用蒸餾水沖洗干凈，自然晾干備用[13]。供應(yīng)金屬離子試劑MnCl2·4H2O和Pb(NO3)2，均為分析純。根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB15618-2008)中的三級(jí)土壤環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)量設(shè)定重金屬離子濃度[14]，試驗(yàn)設(shè)定濃度依次為0，200，400，600，800，1000 mg·L-1。以蒸餾水為對(duì)照。

種子發(fā)芽階段：試驗(yàn)采用紙上發(fā)芽法，每個(gè)塑料發(fā)芽盒內(nèi)鋪雙層濾紙，放入100粒種子，將配置好的金屬溶液置于發(fā)芽盒內(nèi)，至濾紙飽和為止。每個(gè)處理均為5次重復(fù)。系列發(fā)芽試驗(yàn)均在RXZ智能人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行。溫度設(shè)置為20 ℃/30 ℃，每天12 h/12 h(低溫/高溫)，12 h/12 h(光照/黑暗)依次交替，光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1。試驗(yàn)培養(yǎng)周期為15 d，每隔2 d用萬(wàn)分之一天平稱重一次，并使用蒸餾水補(bǔ)充因揮發(fā)而失去的水分，期間保持發(fā)芽盒濕潤(rùn)且無(wú)明水。以芽長(zhǎng)超過(guò)種子本身長(zhǎng)度的1/2作為種子發(fā)芽的標(biāo)志，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)并及時(shí)清理發(fā)霉腐爛的種子。第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第15天時(shí)統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)并測(cè)量幼苗芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)。每個(gè)指標(biāo)3次重復(fù)，取平均值。

苗期階段：待種子培養(yǎng)結(jié)束之后，對(duì)各金屬濃度下的垂穗披堿草幼苗葉片進(jìn)行電導(dǎo)率、葉綠素含量、丙二醛含量的測(cè)定。每個(gè)指標(biāo)3次重復(fù)，取平均值。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1種子萌發(fā)參數(shù)的計(jì)算公式

種子發(fā)芽率(germination percentage) GP=(n/N)×100%

式中：n為最終正常發(fā)芽種子數(shù)，N為供試種子數(shù)。

發(fā)芽勢(shì)(germination vigor) GV=(7 d內(nèi)種子正常發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%[15]

發(fā)芽指數(shù)(germination index) GI=∑(Gt/Dt)

式中：Gt指t日發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)的天數(shù)[16]。

活力指數(shù)(vigor index) VI=GI×Sx

式中：Sx為根平均長(zhǎng)度[17]。

胚根和胚芽長(zhǎng)的測(cè)定：從每個(gè)處理濃度的塑料發(fā)芽盒內(nèi)隨機(jī)取20個(gè)正常生長(zhǎng)的幼苗用直尺進(jìn)行胚根和胚芽長(zhǎng)的測(cè)量，不夠20株的全部都測(cè)，取平均值。

1.3.2幼苗部分生理指標(biāo)的測(cè)定 葉綠素含量測(cè)定采用丙酮浸提法[18]，細(xì)胞質(zhì)膜透性測(cè)定采用電導(dǎo)儀法[18]，丙二醛含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用DPS 6.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，樣本間的差異顯著性用Tukey檢驗(yàn)，圖表用WPS軟件制作，相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mn2+、Pb2+對(duì)垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響

由表1和表2可知，Mn2+、Pb2+對(duì)巴青野生垂穗披堿草種子發(fā)芽率具有極顯著影響(P<0.01)，且隨著Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高，抑制作用越明顯。200 mg·L-1Mn2+、Pb2+溶液濃度處理下，垂穗披堿草種子發(fā)芽率略低于CK，高于400 mg·L-1處理時(shí)則出現(xiàn)較大幅度的下降；當(dāng)Mn2+、Pb2+溶液濃度為1000 mg·L-1時(shí)，發(fā)芽率分別較CK下降了70%和53%。

垂穗披堿草種子發(fā)芽勢(shì)隨Mn2+溶液濃度的升高呈下降趨勢(shì)。垂穗披堿草在Mn2+溶液濃度為0和200 mg·L-1時(shí)，種子發(fā)芽勢(shì)分別為69%和66%，二者無(wú)顯著性差異；600、800 mg·L-1Mn2+溶液濃度處理下，與對(duì)照相比，發(fā)芽勢(shì)顯著下降(P<0.05)；當(dāng)Mn2+溶液濃度達(dá)到1000 mg·L-1時(shí)，種子發(fā)芽勢(shì)僅16%，與CK相比具有極顯著差異(P<0.01)。200、400 mg·L-1Pb2+溶液濃度下垂穗披堿草發(fā)芽勢(shì)和CK無(wú)顯著差異；600、800 mg·L-1Pb2+溶液濃度下垂穗披堿草種子發(fā)芽勢(shì)顯著低于CK(P<0.05)；當(dāng)Pb2+溶液濃度為1000 mg·L-1時(shí)，種子發(fā)芽勢(shì)達(dá)到了最低水平(表1和表2)。

Mn2+、Pb2+離子脅迫對(duì)垂穗披堿草種子發(fā)芽指數(shù)的影響與發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)基本相似。巴青野生垂穗披堿草種子發(fā)芽指數(shù)隨Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高而降低。在Mn2+、Pb2+溶液濃度為200 mg·L-1時(shí)，其發(fā)芽指數(shù)分別為55和52，較對(duì)照略有下降，但無(wú)顯著性差異；在高濃度1000 mg·L-1Mn2+、Pb2+處理下，其發(fā)芽指數(shù)分別為34和30，較CK具有極顯著差異(P<0.01)(表1和表2)。

西藏巴青野生垂穗披堿草種子活力指數(shù)隨Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高呈不斷下降的態(tài)勢(shì)。垂穗披堿草在各Mn2+、Pb2+溶液濃度處理下活力指數(shù)均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于CK，且同等條件下Mn2+比Pb2+的抑制作用顯著，即Mn2+離子脅迫對(duì)垂穗披堿草種子活力指數(shù)的毒害更大(表1和表2)。

表1 Mn2+對(duì)垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of Mn2+ on the seed germination of E. nutans

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note: The different small and capital letters represent significant differences at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same below.

表2 Pb2+對(duì)垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of Pb2+ on the seed germination of E. nutans

由圖1和圖2可知，Mn2+、Pb2+處理對(duì)巴青野生垂穗披堿草胚根和胚芽的生長(zhǎng)影響較大。整體上，垂穗披堿草胚根和胚芽長(zhǎng)隨重金屬離子處理濃度的升高表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)。正常處理?xiàng)l件下，垂穗披堿草胚芽、胚根長(zhǎng)為13.80 cm和5.69 cm；當(dāng)Mn2+、Pb2+溶液濃度為1000 mg·L-1時(shí)，其胚芽、胚根長(zhǎng)度均達(dá)到最低水平，與CK相比，胚芽具有極顯著差異(P<0.01),而胚根具有顯著差異(P<0.05)；200，400，600，800 mg·L-1Mn2+溶液濃度下，與對(duì)照相比，胚芽長(zhǎng)顯著下降(P<0.05)。在200 mg·L-1Mn2+、Pb2+溶液濃度處理下，垂穗披堿草胚根比CK略長(zhǎng)。

圖1 Mn2+對(duì)垂穗披堿草胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of Mn2+ on the radicle length and plumule length of E. nutans

圖2 Pb2+對(duì)垂穗披堿草胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of Pb2+on the radicle length and plumule length of E. nutans

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。The different small and capital letters represent significant differences at 0.05 and 0.01 level, respectively.

2.2 Mn2+、Pb2+對(duì)垂穗披堿草幼苗部分生理指標(biāo)的影響

2.2.1Mn2+、Pb2+對(duì)垂穗披堿草幼苗葉綠素含量的影響 由圖3和圖4可知，巴青野生垂穗披堿草幼苗葉片中葉綠素a和葉綠素b含量隨著Mn2+、Pb2+離子脅迫程度的增加呈下降趨勢(shì)。其中，Mn2+離子濃度與葉綠素a和b的相關(guān)關(guān)系分別為y=-2.16x+13.87 (R2=0.95)，y=-1.68x+11.14 (R2=0.97)；Pb2+離子濃度與葉綠素a和b的相關(guān)關(guān)系分別為y=-2.13x+14.23 (R2=0.95)，y=-1.64x+11.50 (R2=0.99)。可見(jiàn)，Mn2+、Pb2+離子濃度與垂穗披堿草葉綠素a和b的含量呈負(fù)相關(guān)。

2.2.2Mn2+、Pb2+對(duì)垂穗披堿草幼苗MDA含量的影響 MDA的含量是植物在逆境中受到傷害程度的標(biāo)志之一。Mn2+、Pb2+對(duì)垂穗披堿草幼苗葉片MDA含量具有極顯著影響(P<0.01)(圖5)。幼苗葉片MDA含量隨著Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高而增加，幾乎呈直線水平上升。其中，Mn2+離子濃度與垂穗披堿草幼苗葉片MDA含量的相關(guān)關(guān)系為y=6.28x-4.07 (R2=0.99)；Pb2+離子濃度與垂穗披堿草幼苗葉片MDA含量的相關(guān)關(guān)系為y=5.31x-4.47 (R2=0.98)。

2.2.3Mn2+、Pb2+對(duì)垂穗披堿草幼苗葉片質(zhì)膜透性的影響 隨著Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高，垂穗披堿草幼苗葉片電導(dǎo)率明顯升高(圖6)。1000 mg·L-1Mn2+、Pb2+溶液濃度處理下，幼苗葉片電導(dǎo)率達(dá)到最大值，與對(duì)照相比，分別增加了38.90%和34.66%。Mn2+離子脅迫濃度與垂穗披堿草幼苗葉片電導(dǎo)率的相關(guān)關(guān)系為y=8.07x-2.44 (R2=0.99)；Pb2+離子脅迫濃度與垂穗披堿草幼苗葉片電導(dǎo)率的相關(guān)關(guān)系為y=7.36x-2.99(R2=0.98)?？梢?jiàn)，Mn2+、Pb2+脅迫濃度與垂穗披堿草幼苗葉片電導(dǎo)率呈正相關(guān)。

圖3 Mn2+、Pb2+對(duì)垂穗披堿草葉綠素a含量的影響Fig.3 Effects of Mn2+, Pb2+ on the chlorophyll a content of E. nutans

圖4 Mn2+、Pb2+對(duì)垂穗披堿草葉綠素b含量的影響Fig.4 Effects of Mn2+, Pb2+ on the chlorophyll b content of E. nutans

圖5 Mn2+、Pb2+對(duì)垂穗披堿草MDA含量的影響Fig.5 Effects of Mn2+， Pb2+ on the malondialdehyde content of E. nutans

圖6 Mn2+、Pb2+對(duì)垂穗披堿草葉片電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effects of Mn2+， Pb2+ on the electrical conductance of E. nutans

3 討論

本研究結(jié)果表明，Mn2+、Pb2+對(duì)巴青野生垂穗披堿草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)具有極顯著影響(P<0.01)。Mn2+、Pb2+在抑制垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出了一定的相似性。隨著 Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)出現(xiàn)了不同程度的下降趨勢(shì)，這與多人研究結(jié)果相類似[19-20]?？赡苁荕n2+、Pb2+離子抑制了種子蛋白質(zhì)的分解，使酶活性降低，從而影響了種子萌發(fā)。

根是植物吸收和積累重金屬的主要器官，也是最直接的受害部位。試驗(yàn)顯示，隨著Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高，整體上西藏巴青縣野生垂穗披堿草種子胚芽和胚根長(zhǎng)表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)，這和其他植物對(duì)金屬脅迫的反應(yīng)一致[21]。原因可能是高濃度培養(yǎng)液使大量Mn2+、Pb2+富集在植物根部，使得根尖細(xì)胞無(wú)法正常分裂或分裂速度減慢，抑制了根的伸長(zhǎng)，最終影響到整個(gè)植株的生長(zhǎng)[22]。然而，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，200 mg·L-1Mn2+、Pb2+溶液濃度處理下垂穗披堿草胚根比CK略長(zhǎng)，但差異不顯著。說(shuō)明在輕度金屬脅迫條件下垂穗披堿草更多的生物量用于根部生長(zhǎng)，即將有限的養(yǎng)分資源優(yōu)先分配到根部以求得生存。

葉綠素含量的多少與牧草的光合作用及其強(qiáng)度密切相關(guān)[23]。本試驗(yàn)中，垂穗披堿草幼苗葉片葉綠素a和b均隨 Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高而降低，可能是金屬脅迫使葉綠體內(nèi)的酶活性比例失調(diào)，葉綠素分解加快而導(dǎo)致葉綠素含量下降。這與岑畫(huà)夢(mèng)等[24]在Cd2+對(duì)狗牙根(Cynodondactylon)、假儉草(Eremochloaophiuroides)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響研究結(jié)果相似。

MDA是膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用的主要產(chǎn)物，其含量成為鑒別植物細(xì)胞膜破壞程度的指標(biāo)之一。本研究顯示，隨著 Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高，垂穗披堿草幼苗葉片MDA呈上升趨勢(shì)，可能是Mn2+、Pb2+離子引起氧化脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，且隨著金屬離子脅迫濃度的升高幼苗葉片MDA含量越高[25]。與葉片MDA含量變化趨勢(shì)相似，幼苗葉片電導(dǎo)率隨著Mn2+、Pb2+溶液濃度的升高呈上升變化趨勢(shì)。可能是高濃度的金屬脅迫破壞了幼苗葉片細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)的一些可溶性物質(zhì)外滲，導(dǎo)致膜滲透性增大[26]。

4 結(jié)論

Mn2+、Pb2+對(duì)西藏巴青縣野生垂穗披堿草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)具有抑制作用，并對(duì)垂穗披堿草胚根和胚芽的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。西藏巴青縣野生垂穗披堿草對(duì)Mn2+、Pb2+具有一定的耐受性，即使在800 mg·L-1Pb2+和600 mg·L-1Mn2+溶液濃度處理下，其發(fā)芽率仍高達(dá)50%以上。因此，本研究建議西藏巴青縣野生垂穗披堿草可作為治理西藏Mn2+、Pb2+土壤污染與植被修復(fù)的重要備選草種。

本試驗(yàn)僅研究了Mn2+、Pb2+對(duì)西藏巴青縣野生垂穗披堿草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，在一定程度上揭示了垂穗披堿草對(duì)Mn2+、Pb2+金屬脅迫的生理響應(yīng)機(jī)理。但土壤重金屬污染大部分是屬于復(fù)合污染，因此關(guān)于巴青縣野生垂穗披堿草對(duì)于其他金屬的生理響應(yīng)機(jī)制還需要進(jìn)一步的探索與研究。

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