喬 璐，鄭 嵐，楊照微*，何成彥，方 玲

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130021)

盡管近些年在結(jié)直腸癌的診斷方法和治療手段方面獲得了一定的進(jìn)展[1]，仍然無(wú)法阻止該病死亡率逐步上升的腳步。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌在發(fā)達(dá)國(guó)家中的常見性位列第三，在世界位列第二位[2-4]。許多局限性結(jié)直腸癌患者有微轉(zhuǎn)移的疾病通常在初次診斷中不能被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致診斷后數(shù)年疾病復(fù)發(fā)和死亡。因此，我們認(rèn)為找到一種與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)的標(biāo)志物，對(duì)于降低本病的新發(fā)病例數(shù)及死亡率至關(guān)重要。本研究將樣本分為腫瘤組織及距離腫瘤組織大于5 cm的癌旁正常組織作為對(duì)照組，通過二維質(zhì)譜色譜儀進(jìn)行篩選：差異蛋白34個(gè)，13個(gè)上調(diào)蛋白。本實(shí)驗(yàn)選定上調(diào)表達(dá)的骨膜蛋白Periostin作為研究對(duì)象。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象

收集年齡40-70歲之間的結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及其配對(duì)的癌旁組織(兩類標(biāo)本應(yīng)為相距10 cm以上的組織標(biāo)本)，男性17例，女性13例。

1.2主要試劑

考馬斯亮藍(lán)、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-HCL(pH8.8)、1.0M Tris-HCL(pH6.8)、碘代乙酰胺(IAM)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMED)、十二烷基磺酸鈉、蛋白質(zhì)定量試劑盒(RCDC Protein Assay Kit)購(gòu)于Bio-Rad公司。測(cè)序級(jí)胰酶、二硫代蘇糖醇(DTT)。

1.3方法

(1)蛋白提取及濃度測(cè)定：取清洗干凈的組織標(biāo)本50 g，加入預(yù)冷的蛋白提取試劑中，在低溫環(huán)境下靜置20 min，高速低溫(12 000 rpm，4℃)離心1 h，棄掉沉渣取上清?？捡R斯亮藍(lán)(Bradford)法測(cè)定蛋白濃度，蛋白提取樣品保存于-80℃。(2)二維質(zhì)譜色譜聯(lián)用技術(shù)鑒定蛋白多肽：取酶切的蛋白水解多肽(蛋白∶胰酶=50∶1)溶解于0.1%FA，二維色譜分離條件設(shè)定為：流速2 μl/min，洗脫時(shí)間3 h。質(zhì)譜儀檢測(cè)條件：全掃描后附加10次二級(jí)掃描，碰撞能量：35%。(3)免疫印跡鑒定蛋白的表達(dá)：SDS-PAGE 電泳，經(jīng)濃縮膠、分離膠將蛋白按照分子量的不同進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移分離的蛋白至醋酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，一抗(1∶1000 BSA稀釋)低溫孵育3 h，PBS洗膜/5 min,共計(jì)洗膜5次，每次5 min；二抗(1∶2000 BSA稀釋)室溫孵育，PBS洗膜/5 min,共計(jì)洗膜5次?；瘜W(xué)法(ECL 法)發(fā)光顯色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1質(zhì)譜分析結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白質(zhì)

將得到的圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比對(duì)，得到腫瘤組織中的蛋白豐度與癌旁組織的差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白34個(gè)，其中Periostin蛋白質(zhì)譜結(jié)果見圖1。

圖1 Periostin蛋白中AAAITSDILEALGR序列肽段的串聯(lián)質(zhì)譜圖

2.2免疫印跡驗(yàn)證蛋白Periostin

選取未經(jīng)治療的結(jié)直腸癌組織與癌旁組織，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示：骨膜蛋白Periostin在腫瘤組織中的表達(dá)量高于癌旁正常組織。

A:大腸癌組織；B：大腸癌癌旁組織圖2 Periostin在大腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

3 討論

結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中排名第三[1,2]。多學(xué)科治療的進(jìn)展極大地改善了被診斷為早期疾病的患者的預(yù)后，但是被確診患有晚期疾病的患者的預(yù)后依然很差[3]。在對(duì)人類多種腫瘤組織的研究中均觀察到了細(xì)胞粘附蛋白Periostin的蹤跡。 最近的幾項(xiàng)研究表明，肺癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌的血清骨膜素水平被上調(diào)[6]。數(shù)十位研究人員的研究結(jié)果向我們闡述了Periostin對(duì)于癌癥診斷具有一定的輔助作用。Periostin最初在成骨細(xì)胞中被確定為骨和牙齒形成和維持的重要調(diào)節(jié)者，目前，骨膜蛋白被認(rèn)為是一種異功能分泌細(xì)胞基質(zhì)外蛋白并與胚胎發(fā)育期間的細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)有關(guān)[7,8]。越來越多的證據(jù)表明，Periostin是一種基質(zhì)細(xì)胞蛋白，參與許多基本的生物過程，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和血管生成[9]。Periostin是膠質(zhì)瘤惡性腫瘤和潛在的腫瘤復(fù)發(fā)的強(qiáng)大標(biāo)志物。抑制Periostin后，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞致瘤性的消除為探索靶向Periostin的治療效果提供了支持[10]。本研究，通過二維質(zhì)譜色譜聯(lián)用技術(shù)與免疫印跡方法篩選并驗(yàn)證了骨膜蛋白Periostin在結(jié)直腸癌中的上調(diào)表達(dá)。目前，研究雖然提示我們Periostin蛋白參與了細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)，同時(shí)與腫瘤的轉(zhuǎn)移及血運(yùn)相關(guān)，此外在血清中也能夠檢測(cè)到Periostin的表達(dá)，我們推測(cè)正是由于Periostin的過量表達(dá)，一方面，促進(jìn)了細(xì)胞之間的粘附，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖；另一方面，高表達(dá)的Periostin增強(qiáng)了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而促成了腫瘤的轉(zhuǎn)移。

[1]Dattatreya S.Metastatic colorectal cancer-prolonging overall survival with targeted therapies[J].South Asian J Cancer,2013,2:179.

[2]Herszényi L,Tulassay Z.Epidemiology of gastrointestinal and liver tumors[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2010,14:249.

[3]American Cancer Society.Cancer Facts & Figures for African Americans[R].2013-2014.

[4]Hwang H.Colorectal cancer screening among Asian Americans[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14:4025.

[5]Kudo Y,Siriwardena BS,Hatano H,et al.Periostin:novel diagnostic and therapeutic target for cancer[J].Histol Histopathol,2007,22:1167.

[6]Conway SJ,Molkentin JD.Periostin as a heterofunctional regulator of cardiac development and disease[J].Curr Genomics,2008,9:548.

[7]Sorocos K,Kostoulias X,Cullen-McEwen L,et al.Expression patterns and roles of periostin during kidney and ureter development[J].J Urol,2011,186:1537.

[8]Wei Li,Peng Gao,Yue Zhi,et al.Periostin:its role in asthma and its potential as a diagnostic or therapeutic target[J].Respir Res,2015,16(1):57.

[9]Mikheev AM,Mikheeva SA,Trister AD,et al.RostomilyPeriostin is a novel therapeutic target that predicts and regulates glioma malignancy[J].Neuro Oncol,2015,17(3):372.