楊東升，劉培培，侯松萍

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 呼吸科，吉林 長春130033)

世界銀行和世界衛(wèi)生組織的資料表明，2020年，COPD將位居世界疾病經(jīng)濟負擔的第5位，其居高不下的發(fā)病率和死亡率，為人類生存及經(jīng)濟負擔提出了巨大挑戰(zhàn)[1]。目前某些研究結(jié)果初步顯示細胞免疫參與了COPD的病因、發(fā)病機制、恢復及預(yù)后整個過程[2,3]。如果能通過測定COPD患者外周血淋巴細胞亞群的變化，準確評估COPD急性加重期患者的氣道炎癥以感染為主，還是免疫損傷為主，或者兩者并存，此外，還能對患者免疫力高低做出準確評估，對于指導臨床應(yīng)用激素或增強免疫力的藥物時機的選擇有重要意義?，F(xiàn)本文通過檢測COPD患者外周血淋巴細胞的免疫分型變化，了解T細胞、B細胞、NK細胞等在COPD急性加重期患者的變化，對COPD病人免疫功能進行評估，準確判斷患者是否存在細胞免疫功能紊亂或機體免疫力低下，或者兩者并存，為COPD患者何時用激素、何時用增強免疫力的藥物提供一定的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料

選取吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院2014年12月至2015年9月慢性阻塞性肺疾病患者90例，納入標準：均符合中華醫(yī)學會呼吸病學會2013年修訂版慢性阻塞性肺疾病診治指南[4]。排除標準：不能配合完成支氣管舒張實驗者，合并其它心肝腎等疾病者，近期使用激素、免疫抑制劑等影響免疫功能的患者，伴有其他部位慢性炎癥的患者。確診90例COPD患者，年齡35-77歲，平均65.01±9.76歲，其中男35例，女55例， 根據(jù)COPD患者肺功能FEV1占預(yù)計值百分比的數(shù)值結(jié)果，把患者分為Ⅰ(25例)、Ⅱ(18例)、Ⅲ(22例)、 Ⅳ(25例)四組；根據(jù)患者血氣分析結(jié)果分為呼吸衰竭組(41例)和無呼吸衰竭組(49例)；根據(jù)mMRC呼吸困難癥狀評級結(jié)果分為輕度(22例)、中度(21例)、重度(21例)、極重度(26例)四組[4]；根據(jù)患者病程長短分為≤10年(32例)、10-20年(28例)、≥20年(30例)三組；分別測定上述觀察指標的不同組別患者外周血淋巴細胞免疫分型CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD56+、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值。另選取25例健康人作為正常對照組，年齡36-75歲，平均65.89±11.67 歲，其中男10例，女性15例。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑 CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3- PC5(貨號6607013)；細胞裂解液：OptiLyse○RNO-lysing Solution(貨號：A11894)；流式細胞儀：Beckman Coulter FC500；以上所有試劑均購自美國Beckmen Coulter公司。肺功能測定采用MasterScreenPneumo型肺功能儀 (德國康爾福盛CareFusion公司)，技術(shù)標準參考2005年美國胸科學會和歐洲呼吸協(xié)會共同制定的肺功能測試標準[5]；血氣分析測定采用GEMpremier3500分析檢測儀(美國Instrumentation Laboratory公司)。

1.2.2血液樣本制備 采集患者及正常健康人外周血2 ml，加入到EDTA抗凝的真空管中混勻。取兩只流式細胞儀上樣管，分別命名為同型對照管和實驗管，每管中均加入100 μl抗凝全血，然后分別加入20 μl同型對照抗體和CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5抗體和CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5，充分混勻，避光室溫孵育15 min；然后向每管中加入紅細胞裂解液500 μl，充分混勻，避光孵育10 min后加入500 μl PBS，1 000 r/min離心5 min，棄上清，每管加入500 μl鞘液，混勻，等待上機檢測。血氣分析動脈血由專業(yè)人員采集，采用一次性威世德動脈血氣針，型號3302通用性動脈血氣針，由全自動血液細胞分析儀讀取結(jié)果。

1.2.3指標測定 外周血淋巴細胞亞群及NK細胞檢測均采用流式細胞檢測技術(shù)，由我院中心實驗室專人操作檢測。每管獲取細胞1×104個，以熒光抗體染色陽性細胞所占百分比記錄結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1COPD 組與正常對照組的性別、年齡、身高無顯著性差異，見表1。

表1 COPD急性加重期患者與正常人的一般資料比較

2.2COPD急性加重期患者不同肺功能分級外周血淋巴細胞免疫分型結(jié)果

肺功能III級組與正常對照組相比CD3+CD4+淋巴細胞明顯增高(P<0.05)，具體見表2。

表2 COPD患者不同肺功能分級的外周血淋巴細胞免疫分型結(jié)果

與正常對照組相比較*P<0.05

2.3COPD急性加重期患者不同血氧程度的外周血淋巴細胞免疫分型結(jié)果

CD3+及CD3+CD4+淋巴細胞無呼吸衰竭組較呼吸衰竭組及正常對照組明顯增高(均P<0.01)。CD3-CD56+NK細胞呼吸衰竭組較無呼吸衰竭組明顯增高。CD3+CD4+/CD3+CD8+淋巴細胞比值無呼吸衰竭組與呼吸衰竭組及正常對照組相比均明顯增高(P<0.05)，具體見表3。

表3 COPD患者不同血氧程度的外周血淋巴細胞免疫分型結(jié)果

與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01；無呼衰組與呼衰組比較★P<0.05，★★P<0.01

2.4COPD患者呼吸困難不同嚴重程度的外周血淋巴細胞免疫分型結(jié)果

CD3+淋巴細胞mMRC 0-1級組與正常對照組及mMRC3-4級組比較，均明顯增高，前者P<0.05，后者P<0.01；mMRC 2-3級組較mMRC3-4級組明顯增高(P<0.05)。CD3+CD4+淋巴細胞mMRC2-3級組較正常對照組及mMRC3-4級組明顯增高(均P<0.01)，CD3+CD56+NK細胞mMRC3-4級組與mMRC 0-1級組比較明顯增高(P<0.05)，見表4。

表4 COPD患者呼吸困難不同程度的外周血淋巴細胞免疫分型結(jié)果

與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01；mMRC 0-1級組與mMRC3-4級組比較,◢P<0.05，◢◢P<0.01；mMRC 2-3級組與mMRC3-4級組比較★P<0.05，★★P<0.01

2.5COPD急性加重期患者不同病程外周血淋巴細胞免疫分型結(jié)果

CD3+淋巴細胞病程≤10年組較正常對照組明顯升高(P<0.05),見表5。

表5 COPD急性加重期患者不同病程外周血淋巴細胞免疫分型結(jié)果

與正常對照組比較*P<0.05

3 討論

慢性阻塞性肺疾病是發(fā)病率居高不下的慢性炎癥性疾病，越來越多的研究表明T、B、NK細胞等在調(diào)節(jié)COPD的慢性炎癥反應(yīng)中起到了重要作用，因此，研究免疫性致病因素在COPD疾病進展中的作用具有重要意義。本文表3顯示：COPD急性加重期無呼吸衰竭的患者，外周血CD3+、CD3+CD4+淋巴細胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值明顯高于呼吸衰竭組及正常對照組；表4顯示CD3+淋巴細胞mMRC 0-1級組與正常對照組及mMRC3-4級組比較，均明顯增高；mMRC 2-3級組較mMRC3-4級組明顯增高(P<0.05)；表4還顯示CD3+CD4+淋巴細胞mMRC2-3級組較正常對照組及mMRC3-4級組明顯增高(均P<0.01)。結(jié)合表2顯示COPD肺功能III級患者也以CD3+CD4+淋巴細胞增高為主；表5顯示CD3+淋巴細胞病程≤10年組較正常對照組明顯升高(P<0.05)。這些結(jié)果提示COPD早、中期患者，外周血CD3+、CD3+CD4+淋巴細胞反應(yīng)明顯強于正常人和呼吸衰竭病人。另外，表3還顯示CD3-CD56+NK細胞呼吸衰竭組較無呼吸衰竭組明顯增高，并且，表4也顯示CD3+CD56+NK細胞mMRC3-4級組與mMRC 0-1級組比較也明顯增高。總之，上述結(jié)果表明COPD患者早期至中期階段，無呼吸衰竭之前，以CD3+、CD3+CD4+淋巴細胞參與COPD的炎癥反應(yīng)為主；有呼吸衰竭時以CD3-CD56+NK細胞參與COPD的炎癥反應(yīng)為主。

表3顯示無呼吸衰竭的COPD患者其CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值明顯增高，這可能是由于COPD患者出現(xiàn)呼吸衰竭前，機體的免疫系統(tǒng)受COPD急性加重因素的刺激，患者體內(nèi)多種類型的淋巴細胞被顯著激活、積極參與機體的免疫反應(yīng)所致；表3還顯示呼吸衰竭的COPD患者其CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值與正常對照組相比，無明顯增高，考慮其原因是隨著病情加重，COPD患者出現(xiàn)呼吸衰竭，機體缺氧、二氧化碳潴留嚴重，免疫功能受到一定程度的損傷，機體的免疫系統(tǒng)受COPD急性加重因素的刺激后，CD3+CD4+/CD3+CD8+雖然增高，但是，免疫系統(tǒng)對外來刺激免疫應(yīng)答反應(yīng)強度有限所致。

CD56分子是自然殺傷細胞 (NK細胞)表面主要的表面標志，NK細胞不僅是機體內(nèi)的第一道免疫防御屏障，而且也具有免疫調(diào)節(jié)功能，對T、B淋巴細胞、骨髓干細胞具有調(diào)控作用(免疫自穩(wěn))；在機體抗感染過程中也發(fā)揮重要作用。本文研究結(jié)果顯示呼吸困難評分mMRC3-4級組以CD3+CD56+增高為主，CD3-CD56+NK細胞呼吸衰竭組較無呼吸衰竭組明顯增高，說明NK細胞參與了COPD極重度患者的疾病進展過程，可能隨著患者病情加重，NK細胞逐漸被激活，進一步發(fā)揮其免疫調(diào)控作用和抗感染作用。有研究結(jié)果表明COPD患者外周血NK、NK-T細胞數(shù)量下降，并且其細胞毒性功能也降低[6]。Ying Tang等研究表明NK細胞在COPD急性發(fā)作期數(shù)量顯著增高，但是其分泌IFN-γ的功能下降[7]。因此，NK細胞在COPD患者急性加重期的數(shù)量和功能變化還有待進一步研究。

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[2]Tan D,Fernandez S,Price P,et al.Impaired function of regulatory T-cells in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD)[J].Immunobiology,2014,219(12):975.

[3]Jia H,Yongchang S,Yu H,et al.Imbalance between subpopulations of regulatory T cells in COPD.[J].Thorax,2013,68(12):1131.

[4]慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)，中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2013,36(4)：255.

[5]Pellegrino R,Viegi G,Brusasco V,et al.Interpretative strategies for lung function tests.[J].European Respiratory Journal,2005,26(5):948.

[6]Urbanowicz R A,Lamb J R,Todd I,et al.Altered effector function of peripheral cytotoxic cells in COPD[J].Respiratory Research,2009,10:53.

[7] Tang Y,Li X,Wang M,et al.Increased numbers of NK cells,NKT-like cells,and NK inhibitory receptors in peripheral blood of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Clinical & Developmental Immunology,2013,2013(5):198.