□ 李苗苗 烏海市檢驗檢測中心

能力驗證是利用實驗室間比對來判定實驗室或檢查機構能力的活動，是檢驗實驗室檢測水平的一項重要渠道。實驗室能夠利用能力驗證這種外部質量控制手段，識別與其他實驗室之間的差別，監(jiān)督和改進檢測人員的檢測能力，對所用方法和儀器進行確認，并結合實驗室的內部質控，為自身的不斷改進和完善質量管理體系提供重要信息。2018年7月份本中心微生物實驗室參加了由中國食品藥品檢定研究院負責實施的“NIFD-PT-147食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢出能力驗證”。2018年12月實施單位公布烏海市檢驗檢測中心檢測結果為“首次滿意”（首次即非補測），本文通過探討食品中單增李斯特氏菌檢出能力驗證過程，為今后實驗室致病性微生物的檢出能力提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品由中國食品藥品檢定研究院提供，樣品為兩個凍干細菌混合樣，編號：CODE106、CODE261。

1.2 標準菌株

陰性對照菌英諾克李斯特氏菌，菌株編號ATCC33090；陽性對照菌1單增李斯特氏菌，菌株編號CICC 21635；陽性對照菌2伊氏李斯特氏菌，菌株編號ATCC 19119。

1.3 試劑與儀器

李斯特氏菌增菌肉湯（LB1、LB2）基礎（批號：180412）、吖啶黃素3.0 mg（批號：180418）、吖啶黃素5.0 mg（批號：180423）、萘啶酮酸5.0mg（批號：180419）、萘啶酮酸4.0mg（批號：180413）、PALCAM瓊 脂 平 板（ 批 號：180426）、TAS-YE平 板（ 批 號：171201）、血瓊脂平板（批號：180621）、SIM 培 養(yǎng) 基（ 批 號：180621），以上培養(yǎng)基均購自北京路橋技術股份有限公司；李斯特氏菌顯色平板（批號：P 001190），購自法國科馬嘉。所使用培養(yǎng)基均在有效期內。

革蘭氏陽性細菌鑒定卡（以下簡稱GP卡），購自法國梅里埃公司（編號：2420501103）；VITEK 2 COMPACT全自動細菌鑒定儀、電子比濁儀，購自法國生物梅里埃公司。

1.4 方法

按NIFD-PT-147 食品中單增李斯特菌檢出能力驗證作業(yè)指導書和食品安全國家標準《食品微生物學檢驗 食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30-2016）進行檢測。

1.4.1 增菌

無菌操作將兩個西林瓶內小球分別加入到10mL LB1中，充分溶解并混勻，同時做空白對照，30℃培養(yǎng)24h，分別移取0.1mL，轉種于10mL LB2增菌液內。

1.4.2 分離

取兩個樣品及空白對照樣的LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，36℃培養(yǎng)24h，同時做陽性和陰性對照。

1.4.3 純化

自選擇性瓊脂平板上分別挑取典型或可疑菌落，在TSA-YE平板上劃線，36℃培養(yǎng)24h。

1.4.4 鑒定

(1)動力試驗：從TSA-YE平板上挑取純培養(yǎng)菌落，穿刺SIM動力培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h，詳見附表。

（2）生化鑒定：從TSA-YE平板上挑取純培養(yǎng)菌落，使用全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

（3）溶血試驗：從TSA-YE平板上挑取純培養(yǎng)菌刺種到血平板上，并刺種陽性對照菌（伊氏李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），36 ℃培養(yǎng) 48h。

1.4.5 結果

食品中單增李斯特氏菌檢出能力驗證結果見表1。

兩個樣品在科馬嘉顯色培養(yǎng)基上長出兩種藍色菌落，其中一種帶有白色暈環(huán)，而另一種不帶有白色暈環(huán)，經VITEK 2 COMPACT鑒定，帶有白色暈環(huán)的藍色菌落為單增李斯特氏菌（99% Listeria monocytogenes）,而不帶有白色暈環(huán)的藍色菌落為英諾克李斯特氏菌（99%Listeria innocua），所以兩個樣品均為檢出單增李斯特氏菌。

2 討論

（1）李斯特菌在環(huán)境中無處不在，在絕大多數食品中都能找到[2]實驗過程中，樣品增菌、分離應做空白對照實驗。溶血試驗應帶有陰性對照和陽性對照，否則檢驗者可能對GB 4789.30-2016中“狹窄、清晰明亮溶血圈”和“寬的、輪廓清晰的溶血區(qū)域”沒有相應的衡量標準。

表1 食品中單增李斯特氏菌檢出能力驗證結果

（2）單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌的菌落形態(tài)在PALCAM培養(yǎng)基上無明顯差異，均為圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，原因是PALCAM培養(yǎng)基中含有七葉甙的成分，上述兩種李斯特氏菌均能水解七葉甙，并且與鐵離子產生焰色反應而使菌落為灰綠色，并帶有棕褐色水解圈，從而導致兩種李斯特氏菌無法被有效區(qū)分[3]。而科馬嘉顯色平板可以有效鑒別單增李斯特菌和英諾克李斯特氏菌，前者在科馬嘉顯色平板上為藍色菌落，帶有白色暈環(huán)，而后者為不帶白色暈環(huán)的藍色菌落。

（3）VITEK 2 COMPACT方法 是GB 4789.30-2016允許的鑒定方法，較傳統(tǒng)生化鑒定不僅方法更加準確、快速，還減少了人為因素的干擾[4]。鑒定用菌落宜經過純化培養(yǎng)，避免從顯色平板上直接挑取進行鑒定。因為選擇平板中所含有的特殊化學成分對細菌有毒性，導致藥敏分析反應不靈敏，可能使結果判讀有誤[5]。