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        交叉引物等溫擴增-核酸試紙條技術(shù)檢測蠟樣芽孢桿菌

        2018-03-26 06:22:44萊蕪檢驗檢疫局
        食品安全導(dǎo)刊 2018年33期
        關(guān)鍵詞:檢測

        □ 劉 敏 萊蕪檢驗檢疫局

        蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是比較常見的引發(fā)食源性疾病的病原菌[1]。目前,用于蠟樣芽抱桿菌的檢測方法有常規(guī)平板培養(yǎng)篩選法、PCR、酶反應(yīng)法、免疫學(xué)技術(shù)等。近年發(fā)展起來的交叉引物等溫擴增技術(shù)(Cross Priming Amplification,CPA)對儀器設(shè)備的要求低[2]。本文擬結(jié)合交叉引物等溫擴增技術(shù)和核酸試紙條技術(shù),建立一種高靈敏、高通量、特異性好、操作簡捷的蠟樣芽胞桿菌快速檢測方法。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 菌種與試劑

        蠟樣芽孢桿菌(ATCC7064)、沙門氏菌(ATCC14028)、大腸埃希氏菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)和志賀氏菌(ATCC12022)均為萊蕪檢驗檢疫局技術(shù)中心凍存菌株。甜菜堿、MgS04購自Sigma公司,DNA Ladder Marker、BstDNA聚 合 酶、dNTPs、10×PCR Buffer、10×loading Buffer、rTaq DNA 和DNA快速提取試劑盒購自TaKaRa公司,核酸檢測試劑條和檢測裝置購自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司。試驗中所涉及的微生物培養(yǎng)基均購自北京陸橋公司。

        1.1.2 CPA引物與探針的設(shè)計

        CPA引物及探針序列如表1所示。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 菌株DNA模板的制備

        分別接種蠟樣芽孢桿菌菌株及非蠟樣芽孢桿菌菌株于營養(yǎng)瓊脂平板上,培養(yǎng)18~24h后抽提單菌落細(xì)菌DNA,-20℃保存待用。

        表1 CPA引物及探針序列

        1.2.2 目的基因重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

        以蠟樣芽孢桿菌基因組為模板,用外圍引物進(jìn)行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。該PCR反應(yīng)體系為 BCOF 0.8μmol/L 、BCOR 0.8 μmol/L、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs 2.0 μL 以 及 rTaq 0.3 μL,加水補足至25.0 μL。反應(yīng)條件:94℃ 5min;94℃ 30s、60℃ 30s、72℃30s,30個循環(huán);72℃5min。1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物是否與目的片段大小一致。切膠回收轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞,提取重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序分析,驗證產(chǎn)物是否為蠟樣芽孢桿菌核酸反應(yīng)的特異性目標(biāo)片段。

        1.2.3 CPA反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

        以蠟樣芽孢桿菌基因組為模板,用1對外圍引物、1對交叉引物及2條標(biāo)記后的探針,按照通用的CPA擴增條件組成20 μl的反應(yīng)體系。在63℃恒溫條件下反應(yīng)60min,凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測,驗證用于CPA擴增的引物及探針是否可行[3]。

        1.2.4 CPA結(jié)合核酸試紙條法判定檢測結(jié)果

        取擴增產(chǎn)物,采用核酸試紙條進(jìn)行結(jié)果判定。當(dāng)檢測線和質(zhì)控線同時出現(xiàn)紅色條帶,則判為陽性,表明樣本中含有被檢測的目標(biāo)核酸產(chǎn)物。若檢測線沒有條帶出現(xiàn),而只有質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶,則判為陰性,表明未檢測出目的核酸產(chǎn)物[4]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 蠟樣芽孢桿菌gyrB基因片段陽性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證

        電泳結(jié)果表明,該擴增片段與目的序列一致,其大小約為330bp,測序結(jié)果也表明該PCR擴增產(chǎn)物即為蠟樣芽孢桿菌gyrB基因的特異性序列。

        2.2 CPA擴增反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

        圖1 CPA擴增反應(yīng)體系的優(yōu)化

        結(jié)果如圖1所示,A中當(dāng)Mg2+濃度為3.0~4.5mmol/L時,均出現(xiàn)電泳條帶;但當(dāng)Mg2+濃度為4.0mmol/L時,條帶最亮,即為最佳Mg2+使用濃度。B中,dNTPs濃度在0.2~0.6mmol/L范圍內(nèi)均能發(fā)生有效擴增,但當(dāng)濃度為0.5mmol/L時,電泳條帶最亮,即為最佳dNTPs濃度。C中,在甜菜堿濃度為0.6~1.2mol/L時均有較清晰的電泳條帶出現(xiàn),且亮度隨著甜菜堿濃度增大而增大,當(dāng)1.0mol/L時條帶最亮,即甜菜堿的最佳濃度。D中,當(dāng)Bst DNA polymerase濃度為8U和10U時電泳條帶最亮,且目測二者亮度基本相當(dāng),為節(jié)約試驗成本,選取8.0U為最佳的Bst DNA polymerase使用濃度。E中,當(dāng)溫度為60℃時,出現(xiàn)較為明顯的電泳條帶,最亮條帶出現(xiàn)在62℃,高于此溫度后,擴增條帶開始變暗,則最佳反應(yīng)溫度為62℃。F中,當(dāng)反應(yīng)時間為30min時CPA反應(yīng)無法發(fā)生,45min時有輕微的擴增條帶出現(xiàn)但較暗,最亮電泳條帶出現(xiàn)在60~75min,反應(yīng)時間超過75min后條帶逐漸變暗,則最佳反應(yīng)時間為60min。

        3 討論

        本研究針對蠟樣芽胞桿菌特異性基因gyrB保守區(qū)域設(shè)計引物進(jìn)行交叉引物恒溫擴增,建立了可用于快速篩選蠟樣芽胞桿菌的CPA-核酸試紙條法。在該反應(yīng)體系的建立過程中,通過分析比較反應(yīng)體系中多個因素的優(yōu)化結(jié)果,發(fā)現(xiàn)Mg2+、dNTPs、甜菜堿、Bst DNA polymerase濃度以及反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間均能影響檢測效果。但該方法的檢測靈敏度有待進(jìn)一步研究。

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