□ 劉 敏 萊蕪檢驗檢疫局

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是比較常見的引發(fā)食源性疾病的病原菌[1]。目前，用于蠟樣芽抱桿菌的檢測方法有常規(guī)平板培養(yǎng)篩選法、PCR、酶反應(yīng)法、免疫學(xué)技術(shù)等。近年發(fā)展起來的交叉引物等溫擴增技術(shù)（Cross Priming Amplification，CPA）對儀器設(shè)備的要求低[2]。本文擬結(jié)合交叉引物等溫擴增技術(shù)和核酸試紙條技術(shù)，建立一種高靈敏、高通量、特異性好、操作簡捷的蠟樣芽胞桿菌快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與試劑

蠟樣芽孢桿菌（ATCC7064）、沙門氏菌（ATCC14028）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）和志賀氏菌（ATCC12022）均為萊蕪檢驗檢疫局技術(shù)中心凍存菌株。甜菜堿、MgS04購自Sigma公司，DNA Ladder Marker、BstDNA聚 合 酶、dNTPs、10×PCR Buffer、10×loading Buffer、rTaq DNA 和DNA快速提取試劑盒購自TaKaRa公司，核酸檢測試劑條和檢測裝置購自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司。試驗中所涉及的微生物培養(yǎng)基均購自北京陸橋公司。

1.1.2 CPA引物與探針的設(shè)計

CPA引物及探針序列如表1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株DNA模板的制備

分別接種蠟樣芽孢桿菌菌株及非蠟樣芽孢桿菌菌株于營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)18～24h后抽提單菌落細(xì)菌DNA，-20℃保存待用。

表1 CPA引物及探針序列

1.2.2 目的基因重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

以蠟樣芽孢桿菌基因組為模板，用外圍引物進(jìn)行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。該PCR反應(yīng)體系為 BCOF 0.8μmol/L 、BCOR 0.8 μmol/L、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs 2.0 μL 以 及 rTaq 0.3 μL，加水補足至25.0 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s、60℃ 30s、72℃30s，30個循環(huán)；72℃5min。1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物是否與目的片段大小一致。切膠回收轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，提取重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，驗證產(chǎn)物是否為蠟樣芽孢桿菌核酸反應(yīng)的特異性目標(biāo)片段。

1.2.3 CPA反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

以蠟樣芽孢桿菌基因組為模板，用1對外圍引物、1對交叉引物及2條標(biāo)記后的探針，按照通用的CPA擴增條件組成20 μl的反應(yīng)體系。在63℃恒溫條件下反應(yīng)60min，凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，驗證用于CPA擴增的引物及探針是否可行[3]。

1.2.4 CPA結(jié)合核酸試紙條法判定檢測結(jié)果

取擴增產(chǎn)物，采用核酸試紙條進(jìn)行結(jié)果判定。當(dāng)檢測線和質(zhì)控線同時出現(xiàn)紅色條帶，則判為陽性，表明樣本中含有被檢測的目標(biāo)核酸產(chǎn)物。若檢測線沒有條帶出現(xiàn)，而只有質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶，則判為陰性，表明未檢測出目的核酸產(chǎn)物[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌gyrB基因片段陽性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證

電泳結(jié)果表明，該擴增片段與目的序列一致，其大小約為330bp，測序結(jié)果也表明該PCR擴增產(chǎn)物即為蠟樣芽孢桿菌gyrB基因的特異性序列。

2.2 CPA擴增反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

圖1 CPA擴增反應(yīng)體系的優(yōu)化

結(jié)果如圖1所示，A中當(dāng)Mg2+濃度為3.0～4.5mmol/L時，均出現(xiàn)電泳條帶；但當(dāng)Mg2+濃度為4.0mmol/L時，條帶最亮，即為最佳Mg2+使用濃度。B中，dNTPs濃度在0.2～0.6mmol/L范圍內(nèi)均能發(fā)生有效擴增，但當(dāng)濃度為0.5mmol/L時，電泳條帶最亮，即為最佳dNTPs濃度。C中，在甜菜堿濃度為0.6～1.2mol/L時均有較清晰的電泳條帶出現(xiàn)，且亮度隨著甜菜堿濃度增大而增大，當(dāng)1.0mol/L時條帶最亮，即甜菜堿的最佳濃度。D中，當(dāng)Bst DNA polymerase濃度為8U和10U時電泳條帶最亮，且目測二者亮度基本相當(dāng)，為節(jié)約試驗成本，選取8.0U為最佳的Bst DNA polymerase使用濃度。E中，當(dāng)溫度為60℃時，出現(xiàn)較為明顯的電泳條帶，最亮條帶出現(xiàn)在62℃，高于此溫度后，擴增條帶開始變暗，則最佳反應(yīng)溫度為62℃。F中，當(dāng)反應(yīng)時間為30min時CPA反應(yīng)無法發(fā)生，45min時有輕微的擴增條帶出現(xiàn)但較暗，最亮電泳條帶出現(xiàn)在60～75min，反應(yīng)時間超過75min后條帶逐漸變暗，則最佳反應(yīng)時間為60min。

3 討論

本研究針對蠟樣芽胞桿菌特異性基因gyrB保守區(qū)域設(shè)計引物進(jìn)行交叉引物恒溫擴增，建立了可用于快速篩選蠟樣芽胞桿菌的CPA-核酸試紙條法。在該反應(yīng)體系的建立過程中，通過分析比較反應(yīng)體系中多個因素的優(yōu)化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Mg2+、dNTPs、甜菜堿、Bst DNA polymerase濃度以及反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間均能影響檢測效果。但該方法的檢測靈敏度有待進(jìn)一步研究。