李中軒，陳韻岱

糖尿病是一種復(fù)雜的代謝綜合征，特點(diǎn)是血糖升高伴隨胰島功能降低。糖尿病高血糖會導(dǎo)致血管相關(guān)并發(fā)癥，包括視網(wǎng)膜病變、腦血管病變、心血管病變[1]。其中心血管病變最為嚴(yán)重，糖尿病產(chǎn)生多種有害代謝產(chǎn)物，如晚期糖化終末產(chǎn)物（AGEs）[2]，會損傷完整的血管內(nèi)皮，并誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)過一系列病理生理過程最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊形成。若不穩(wěn)定斑塊發(fā)生破裂出血，將導(dǎo)致心肌梗死和心源性死亡。與正常人群相比，糖尿病患者伴隨胰島功能受損，加速膽固醇在巨噬細(xì)胞中聚集，形成泡沫細(xì)胞[3]，加速冠心病進(jìn)展。同時糖尿病患者損傷的內(nèi)皮會釋放多種炎癥因子，加重氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致嚴(yán)重心血管事件發(fā)生[4]。

修復(fù)損傷血管內(nèi)皮成為治療糖尿病相關(guān)心血管病變的重要靶點(diǎn)。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在修復(fù)損傷、維持管腔完整性等方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)EPCs不僅參與血管形成，同時也參與出生后血管生成和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)[5,6]。高糖環(huán)境會損傷EPCs，導(dǎo)致其功能障礙。本研究探究了不同濃度葡萄糖對EPCs增殖、遷移及血管形成能力的影響，為后續(xù)在高糖環(huán)境下研究EPCs病理生理機(jī)制提供合適的模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑 SPF級SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。EGM-2培養(yǎng)基（Lonza），histopaque-1083（Sigma-Aldrich），F(xiàn)ibronectin（R&D），胎牛血清（Gibco），DilacLDL（Thermo Fisher Scientific），F(xiàn)ITC-UEA-I（Sigma-Aldrich），結(jié)晶紫（Beyotime），基質(zhì)膠（Corning），Cell counting kit-8（Dojindo Molecular Technologies），24-well Transwell chamber（Corning），酶標(biāo)儀（BioTek），熒光倒置顯微鏡（Nikon），激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica Microsystems）。

1.2 EPCs的分離與培養(yǎng) 將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，頸椎脫臼法處死。然后將處死大鼠放入預(yù)先準(zhǔn)備好的75%酒精中消毒30 min。分離出大鼠后肢長骨，將表面神經(jīng)、肌肉、筋膜盡量去除，暴露出兩側(cè)干骺端。用吸取EGM-2培養(yǎng)基的注射器至干骺端刺入后反復(fù)沖洗，直至骨髓腔內(nèi)容物被完全吹出，長骨變白。反復(fù)吹打分離得到的骨髓腔內(nèi)容物至分散均勻，將骨髓沖洗液用0.22 μm濾器過濾，得到骨髓單細(xì)胞懸液。1:1比例將淋巴細(xì)胞分離液與單細(xì)胞懸液依次加入離心管中，室溫1400 rpm離心30 min。吸出骨髓單個核細(xì)胞層與EGM-2培養(yǎng)基重懸，室溫1000 rpm離心10 min洗滌2遍。然后將骨髓單個核細(xì)胞接種于纖維蛋白包被的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)12 h。首次更換培養(yǎng)基輕搖培養(yǎng)皿，將未貼壁細(xì)胞重新接種于另一纖維蛋白包被的培養(yǎng)皿上，換液步驟同原培養(yǎng)皿。以后每24 h更換一次培養(yǎng)基，在此過程中將非EPCs集落刮除，待細(xì)胞融合至80%時進(jìn)行傳代。1.3 EPCs吞噬功能鑒定 通過吞噬結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定EPCs吞噬Dil-acLDL與FITC-UEA-I結(jié)合的特性。將生長狀態(tài)良好的EPCs用0.25%胰蛋白酶消化，吹散細(xì)胞使之變?yōu)閱渭?xì)胞懸液。胎牛血清中和胰蛋白酶后，用EGM-2培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度。24孔板每孔1×104個細(xì)胞制作爬片。細(xì)胞長至80%進(jìn)行染色。稀釋Dil-acLDL濃度至10 μg/ml，F(xiàn)ITCUEA-I至20 μg/ml，同時加入孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育4 h。預(yù)冷PBS浸洗10 min。用4%多聚甲醛4℃固定1 h。再用PBS浸洗3遍，每次10 min。封片后在激光共聚焦顯微鏡下任選5個視野，觀察并計(jì)算熒光雙染細(xì)胞數(shù)量。

1.4 EPCs增殖能力檢測及繪制生長曲線 CCK-8試劑盒檢測EPCs在不同濃度葡萄糖中的增殖能力。將EPCs分為5組，EGM-2培養(yǎng)基含有5 mM葡萄糖，將5 mM組設(shè)為對照組，添加葡萄糖使10 mM組、15 mM組、20 mM組、25 mM組達(dá)到相應(yīng)的濃度，每組設(shè)置3個復(fù)孔，共觀察72 h。每12 h檢測一次，將原培養(yǎng)基去除后，1:10的比例加入CCK-8與新培養(yǎng)基，避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。

1.5 EPCs遷移能力檢測 通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測EPCs在不同濃度葡萄糖條件下的遷移能力。Transwell小室中加入培養(yǎng)基平衡1 h，每孔1×104個細(xì)胞用無FBS的EGM-2培養(yǎng)基重懸后加入上室，下室加入含有10% FBS及不同濃度葡萄糖的EGM-2培養(yǎng)基。將小室放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，未遷移至下室的細(xì)胞用棉簽輕輕擦去。下室細(xì)胞用4%多聚甲醛固定1 h，PBS洗滌3遍。最后用結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下任選5個視野觀察并計(jì)數(shù)。

1.6 EPCs體外血管形成能力檢測 于使用前一晚將基質(zhì)膠放入冰箱中使之融化。96孔板每孔加入100 μl基質(zhì)膠，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱使之凝固，然后每孔加入1×104個細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察并計(jì)算新生管壁的長度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理所有的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠EPCs形態(tài)學(xué)觀察 大鼠骨髓來源原代EPCs培養(yǎng)12 h后，第一次換液，貼壁細(xì)胞呈類圓形，細(xì)胞體積?。▓D1A）。細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞兩端逐漸伸出偽足，細(xì)胞體積增大，呈紡錘形集落分布（圖1B）。繼續(xù)培養(yǎng)至14 d，細(xì)胞緊密排列，呈典型的鋪路石樣分布（圖1C），細(xì)胞融合成片，為三角或多邊形（圖1D）。培養(yǎng)過程中不斷清除非EPCs集落。2.2 大鼠EPCs鑒定 于激光共聚焦顯微鏡下觀察，吞噬Dil-acLDL后EPCs呈現(xiàn)紅色（圖2A），特異性結(jié)合FITC-UEA-I后EPCs呈綠色（圖2B）。將圖片融合后顯示黃色的為EPCs（圖2C），陽性率為（93.10±0.85）%。陰性對照細(xì)胞未能觀察到熒光。

圖1 大鼠原代EPCs形態(tài)學(xué)觀察

圖2 大鼠EPCs鑒定

2.3 不同濃度葡萄糖對EPCs增殖能力的影響 各組細(xì)胞葡萄糖干預(yù)后，每12 h測量一次吸光度值并繪制生長曲線。結(jié)果顯示，同一時間點(diǎn)隨著葡萄糖濃度升高，吸光度值降低，增殖下降，培養(yǎng)72 h后，在25 mM達(dá)到最大抑制程度。同一濃度，12 h開始進(jìn)入對數(shù)生長期，48 h進(jìn)入平臺期（圖3）。

圖3 不同濃度葡萄糖對EPCs增殖的影響

2.4 不同濃度葡萄糖對EPCs遷移能力的影響 隨著葡萄糖濃度的升高，遷移至下室EPCs比例逐漸減少（5 mM：1.00±0.05；10 mM：0.68±0.06；15 mM：0.56±0.03；20 mM：0.40±0.04；25 mM：0.23±0.03）（圖4A～E），與5 mM組對比，25 mM組遷移比例最低[（0.23±0.03） vs .（1.00±0.05）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖4F）。說明高糖抑制EPCs的遷移能力，且25 mM濃度時抑制最明顯。

2.5 不同濃度葡萄糖對EPCs體外血管形成能力的影響 隨著葡萄糖濃度升高，體外血管形成能力逐漸降低，5 mM所形成管腔完整，至25 mM濃度時已基本不能形成完整管腔（5 mM：1.00±0.04；10 mM：0.81±0.04；15 mM：0.70±0.04；20 mM：0.63±0.03；25 mM：0.56±0.03）（圖5A～E）。與5 mM組對比，25 mM組血管形成抑制作用最明顯[（0.56±0.03） vs. （1.00±0.04）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明高糖抑制EPCs體外血管形成能力，且在25 mM時最明顯（圖5F）。

3 討論

圖4 EPCs在不同濃度葡萄糖中的遷移能力

圖5 EPCs在不同濃度葡萄糖條件下的體外血管形成能力

糖尿病不僅增加心血管并發(fā)癥、心血管疾病早期死亡以及致殘率，還加重社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病是動脈粥樣硬化、慢性腎臟衰竭、心力衰竭的病因[8-10]。本研究首先對EPCs形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察以及鑒定，然后觀察不同濃度葡萄糖對EPCs的影響。為后續(xù)EPCs在高糖環(huán)境下的病理生理機(jī)制探究提供合適濃度。

骨髓和外周血來源的EPCs在內(nèi)皮修復(fù)、血管生成、血管新生和改善血管功能中起關(guān)鍵作用。EPCs是內(nèi)源性修復(fù)系統(tǒng)的一個重要組成部分[11]，對心血管系統(tǒng)有重要保護(hù)作用[12]，EPCs在特定刺激下被動員或釋放到血液循環(huán)中，通過旁分泌調(diào)控，參與血管形成和內(nèi)皮修復(fù)[13,14]。

EPCs參與維持心血管穩(wěn)態(tài)，其衰竭或功能障礙可能加速糖尿病相關(guān)心血管并發(fā)癥的發(fā)生。EPCs參與維持心血管損傷和修復(fù)間的平衡，對于維持心臟重塑、心功能、內(nèi)膜完整性、內(nèi)皮功能和預(yù)防心血管并發(fā)癥至關(guān)重要[15]。高糖環(huán)境的EPCs病理生理研究是目前研究熱點(diǎn)。EPCs的遷移和血管新生能力在修復(fù)損傷方面十分重要[16]。

因此，本研究探究不同濃度葡萄糖對EPCs增殖、遷移及體外血管形成能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖濃度的升高，無論是EPCs遷移能力，還是體外血管形成能力均被抑制，25mM時抑制達(dá)到最高程度，為后續(xù)建立高糖模型提供了理論與技術(shù)支持。

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