李紅梅，王顯

支架血栓是介入領域所面臨的挑戰(zhàn)，目前新一代藥物涂層支架血栓發(fā)生率已降至0.2%[1]。盡管支架血栓的發(fā)生率較低，但其后果嚴重，死亡率較高，是經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）最主要的死亡原因之一，如何將血栓形成的風險降至最低是國內外支架研發(fā)的焦點和前沿領域[2]。

研究證實，冠狀動脈平滑肌細胞增殖、遷移引起血管內膜過度增生是導致PCI術后再狹窄的主要原因，涂層藥物抑制平滑肌細胞增殖的同時延緩血管內皮化進程是導致遲發(fā)性血栓形成的關鍵因素[3,4]。在此背景下，本團隊基于前期研究并結合現(xiàn)代藥理研究進展，選用紫杉醇和水蛭素按一定比例組成支架涂層復合物，在小型豬模型研究中效果肯定，且顯示出明顯的抗炎作用，但具體作用機制未知。NF-κB p65是細胞內重要的核轉錄因子，通過調控多種基因表達參與炎癥、免疫、細胞凋亡、細胞增殖等過程[5-8]，在炎癥介質表達的調控中，NF-κB p65被激活和核轉位是關鍵一步[9,10]。本研究選用人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC），用脂多糖（LPS）模擬體內細胞炎癥狀態(tài)，紫杉醇水蛭素進行干預，探討紫杉醇水蛭素復合物對LPS誘導的NF-κB p65細胞信號轉導及下游炎癥因子的影響，從炎癥角度初步探究紫杉醇水蛭素復合藥物防治PCI術后再狹窄和遲發(fā)性血栓形成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 HCASMC（貨號：FC-0031）、細胞培養(yǎng)基、胰酶、胰酶抑制劑、凍存液均購自美國Lifeline公司；細胞培養(yǎng)級脂多糖1 mg/ml（貨號：L6529），Sigma（L2880）；紫杉醇儲存液100 μl（KGA8221），南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；科研級天然水蛭素凍干粉500AT-U/g，武漢勝天宇生物科技有限公司；人IL-6 ELISA試劑盒（貨號：SEA079Hu，96T），人IL-1β ELISA試劑盒（貨號：SEA563Hu，96T），人腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（貨號：SEA133Hu，96T），均購自武漢USCN公司；兔NF-κB p65亞基多克隆抗體，Abcam公司；HRP標記的羊抗兔IgG，武漢博士德公司；TRIZOL通用型RNA快速提取試劑盒，Inventrogen公司；反轉錄試劑盒，美國Bio-Rad公司。

1.2 主要儀器 超凈工作臺CJT-E-Ⅱ（北京昌平長城空氣凈化工程公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus CKX×41）、低速離心機LD4-2（北京雷勃爾離心機有限公司）、培養(yǎng)箱（MCO-20AIC，SANYO Elecronic.Ltd.JAPEN）、-80℃低溫冰箱（美國REVCO Legaci）、電熱恒溫水箱（HH.W21.420）、熒光PCR儀、SDS-PAGE凝膠電泳儀、電轉儀均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 人冠狀動脈平滑肌細胞培養(yǎng) 將保存于液氮中的細胞取出后立刻放到干冰上，然后放入37℃水浴中，待細胞懸液融化后將細胞接種于培養(yǎng)瓶并放入培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基。之后2～3 d傳代一次。實驗使用第4～6代細胞，將生長至融合期的HCASMC以胰蛋白酶消化，細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合成單層開始實驗。

1.3.2 實驗分組及處理 實驗分組：設置空白對照組（正常HCASMC，未做任何處理）、LPS模型組（1 μg/ml的LPS干預48 h）、紫杉醇水蛭素高濃度組（1 μmol/L紫杉醇+0.2 mg/ml水蛭素干預4 h后加入1 μg/ml的LPS刺激48 h）、紫杉醇水蛭素低濃度組（1 μmol/L紫杉醇+0.0125 mg/ml水蛭素干預4 h后加入1 μg/ml的LPS刺激48 h）。每組設置3個復孔。

1.3.3 Q-PCR法測定NF-κB p65、TNF-α、白介素-6（IL-6）和白介素-1β（IL-1β）的mRNA表達 用TRIZOL通用型RNA提取試劑盒提取樣品RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，按照以下反應體系進行：模板（RNA）1 μg；5×Reaction Mix 4 μl；Reverse Transcriptase 1 μl；DEPC處理水至20 μl，混勻，25℃ 5 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。Q-PCR檢測按照以下反應體系進行：模板（cDNA）/ddH2O 7.5 μl；4 μM引物F/R，5 μl；SYBR 12.5 μl，混勻，置于熒光定量PCR儀中。目的基因相對表達量用ΔΔCT法計算，ΔCT（目的基因）=CT（目的基因）－CT（內參基因），ΔΔCT=ΔCT（處理組）－ΔCT（空白組）。目的基因相對表達水平=2-ΔΔCT ，內參β-actin校正（表1）。

表1 各引物序列信息

1.3.4 Western Blotting檢測NF-κB p65的表達 提取細胞總蛋白，檢測濃度，制備樣品，上樣，12% SDS-PAGE電泳3 h，然后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入NF-κB p65一抗（1:1000）、β-actin一抗（1:1000），4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1:2000），室溫孵育1 h，洗滌后發(fā)光壓片，用凝膠圖像掃描儀進行半定量分析。

1.3.5 ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達 吸出孔內培養(yǎng)基，4℃ 12000 r/min離心20 min，吸出上清液待測。ELISA加樣：分別設置標準孔、空白孔和測試孔。標準孔7孔，依次加入100 μl不同濃度的標準品，空白孔加入100 μl標準品稀釋液，余孔加入細胞上清100 μl，設立6個復孔。酶標板加上覆膜，37℃溫育2 h。之后棄去液體，甩干，加檢測溶液，洗滌，每孔加底物溶液90 μl，37℃避光顯色，加終止液終止反應，用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD）值。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞NF-κB p65、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表達比較 與空白對照組比較，LPS模型組NF-κB p65、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），提示成功誘導HCASMC炎性活化。HCASMC經(jīng)高、低濃度紫杉醇水蛭素復合物預處理LPS刺激后，上述指標低于LPS模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（圖1）。

2.2 各組細胞NF-κB p65蛋白表達比較 LPS模型組NF-κB p65蛋白表達水平明顯高于空白對照組，而紫杉醇水蛭素預處理組NF-κB p65蛋白表達水平較LPS模型組明顯降低，其中高濃度處理組降低更為顯著（圖2）。

2.3 各組細胞TNF-α、IL-1β和IL-6表達比較 與空白對照組比較，LPS模型組TNF-α、IL-1β和IL-6表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與LPS模型組比較，紫杉醇水蛭素低濃度與高濃度組TNF-α、IL-1β和IL-6表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。其中高濃度紫杉醇水蛭素復合物干預后IL-1β表達下降較低濃度組更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖1 各組細胞的mRNA表達比較

圖2 各組細胞NF-κB p65蛋白表達比較（n=3）

3 討論

自1977年Gruentzig在世界上完成首例經(jīng)皮冠狀動脈腔內成形術以來，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）在短短30多年間經(jīng)歷了三個階段：單純球囊擴張時代、金屬裸支架時代和藥物洗脫支架（DES）時代，目前PCI已經(jīng)成為狹窄性冠狀動脈疾病的標準治療方法，尤其新一代DES的廣泛使用，然而支架置入后出現(xiàn)的慢性炎癥反應、晚期及極晚期支架血栓形成等風險仍然存在[11-13]。PCI圍手術期血栓形成的機制主要包括兩個環(huán)節(jié)：凝血酶活化和血小板激活，其中凝血反應在該過程中發(fā)揮承上啟下的作用，有效抑制凝血酶在抗細胞增殖、抗再狹窄治療中意義重大[14,15]。

圖3 各組細胞TNF-α、IL-1β和IL-6表達比較

這種背景下，本團隊優(yōu)化現(xiàn)有支架涂層藥物紫杉醇，選擇水蛭素按一定配比組成紫杉醇水蛭素復合物，制備出紫杉醇水蛭素復合藥物涂層支架，小型豬在體試驗中取得滿意效果，且發(fā)現(xiàn)其抗再狹窄和血栓形成作用可能與抑制血管局部的炎癥反應有關。進而選用不同濃度LPS（0.01、0.1、0.5、1、10 μg/m1）刺激HCASMC不同時間（6 h、24 h、48 h），篩選誘導HCASMC炎性活化的最佳條件，摸索出1 μg/ml的LPS干預HCASMC 48h可保證HCASMC處于持續(xù)的高炎性活化狀態(tài)，為本研究抗炎機制探索建立了基礎[16-18]。

本研究在已成功建立的HCASMC炎性活化模型基礎上，分別選用高、低濃度紫杉醇水蛭素復合物對其進行藥物干預，以NF-κB p65及其下游炎癥因子的表達變化作為突破點，發(fā)現(xiàn)高、低濃度紫杉醇水蛭素復合物均能有效下調NF-κB p65及TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達水平，且在蛋白表達過程中發(fā)揮顯著的抑制作用，高濃度的復合藥物體現(xiàn)出更強的抗炎效果。以上結果說明，紫杉醇水蛭素復合物影響LPS激活NF-κB p65的轉錄和表達，下調炎癥活化的級聯(lián)反應，對LPS刺激下的HCASMC具有保護作用，從高、低濃度復合藥物的抗炎效果差異來看，紫杉醇水蛭素復合物對HCASMC的保護作用在一定范圍內呈現(xiàn)劑量依賴性。

NF-κB p65作為動脈粥樣硬化性疾病的始動因素之一，廣泛存在于人體組織細胞中，其被激活后暴露出核定位位點，可快速轉移至細胞核中，大量分泌炎癥因子及趨化因子，造成局部血管脂質沉積，快速促發(fā)平滑肌細胞增殖遷移，直接影響斑塊穩(wěn)定性，并成為導致PCI術后再狹窄及血栓形成的關鍵因素[19,20]。本研究從紫杉醇水蛭素支架涂層復合物對NF-κB p65及其信號轉導通路下游炎癥因子的影響進行了初步探索，為后續(xù)研究奠定了基礎，下一步我們將從經(jīng)典的TLR4-MyD88-NF-κB通路進行深入研究，以期能準確尋找出紫杉醇水蛭素復合物的作用靶點，為其抗PCI術后再狹窄及血栓形成提供科學數(shù)據(jù)支持。

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