吳家棟 綜述，肖 瑞 審校

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)重點實驗室，呼和浩特 050059)

成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR蛋白9(Cas9)是一種多功能的基因組編輯技術(shù)，被稱為分子剪刀，廣泛應(yīng)用于遺傳因子功能的研究、遺傳疾病的臨床前研究、癌癥研究、藥物發(fā)現(xiàn)、精神疾病研究及植物應(yīng)用等領(lǐng)域。CRISPR/Cas9系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)于多種細(xì)菌和古細(xì)菌物種中，已經(jīng)成功地被用于編輯真核生物基因組[1-2]。目前，越來越多的數(shù)據(jù)表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅可以靶向蛋白質(zhì)編碼基因組，而且可以靶向人類的非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)[3-5]。然而，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也有其局限性，它存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，這可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性并破壞其他正常基因的功能[6-7]。癌癥是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一[8]，盡管腫瘤的綜合治療已取得了令人振奮的成果，但是腫瘤的復(fù)發(fā)及放化療過程中出現(xiàn)的不良反應(yīng)等問題大大降低了癌癥患者的生活質(zhì)量[9]，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以糾正導(dǎo)致癌癥的突變，并且是一種可以在基因水平保護(hù)患者的治療技術(shù)[3]，因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)拉開了癌癥治療的新序幕。本文通過總結(jié)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)及其在ncRNA相關(guān)基因組編輯中的最新應(yīng)用，旨在為腫瘤治療的深入研究甚至臨床治療提供新思路。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的概述

迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了3種可編程核酸酶用于基因組編輯，包括鋅指核酸酶(ZFN)[10]，轉(zhuǎn)錄激活劑樣效應(yīng)子因子核酸酶(TALEN)[11-12]和CRISPR相關(guān)蛋白(Cas)系統(tǒng)[13]的RNA引導(dǎo)的核酸酶(RGNs)。在這些核酸酶中，根據(jù)其指導(dǎo)RNA和DNA之間的Watson-Crick堿基配對識別目標(biāo)DNA的Cas9核酸酶實施最簡單，并且迅速成為基因組工程中最流行和有力的工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是來自細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可檢測和降解來自噬菌體和質(zhì)粒的侵染性DNA[14]。1987年末，ISHINO等[15]在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)了聚類重復(fù)片段被一系列間隔序列中斷，該現(xiàn)象后被稱為CRISPR。到目前為止，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10多種不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)，根據(jù)其不同的機(jī)制將其分為3類(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)和許多亞型[16-17]。其中CRISPR/Cas9是一種在化膿鏈球菌中應(yīng)用的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)，由于其具有高效率和高準(zhǔn)確性，是哺乳動物中使用最廣泛的系統(tǒng)[18]。Cas9介導(dǎo)的基因組編輯有3個要求：(1)單鏈向?qū)NA(single guide RNA，sgRNA)序列，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是第一個用于基因組編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng)，部分原因是它含有一個相關(guān)的易編程的sgRNA，只有20個核苷酸長的識別序列[1-2，19]。 sgRNA由具有與靶位點互補(bǔ)序列的CRISPR RNA(crRNA)和分別轉(zhuǎn)錄并部分與crRNA互補(bǔ)的反式激活的crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)組成[1，20-21]。(2)具有核定位信號的Cas9蛋白，為了發(fā)揮基因組編輯功能，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還需要與這兩種RNA組分緊密相關(guān)的關(guān)鍵酶組分Cas9核酸酶[18]，這些RNA需要將Cas9蛋白引導(dǎo)到靶位點并激活Cas9核酸酶。(3)前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)，sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，并嚴(yán)格識別位于靠近PAM的3′末端側(cè)翼的靶向互補(bǔ)DNA序列，其通常由NGG或NAG(N可為A，T，G或C)組成，然后啟動DNA雙鏈斷裂(DSBs)[9]。從理論上講，帶有PAM的任何基因組序列都可以由Cas9用特定的sgRNA進(jìn)行編輯，由于基因組中PAM的高發(fā)生率，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的sgRNA幾乎可以靶向所有的基因。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)

雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)與ZFN、TALEN等其他的基因組編輯技術(shù)相比有許多優(yōu)勢，但它仍有一些嚴(yán)重的缺點亟待解決，例如脫靶效應(yīng)，也就是說Cas9可能會錯誤地結(jié)合到目標(biāo)位點之外的序列內(nèi)并產(chǎn)生突變，引起一些嚴(yán)重的后果[5，22-23]。SCHAEFER等[24]采用全基因組測序檢測經(jīng)CRISPR處理的小鼠細(xì)胞的脫靶情況，結(jié)果顯示，在經(jīng)CRISPR/Cas9體內(nèi)編輯后誘導(dǎo)出高數(shù)目的突變，該研究表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)是一個廣泛存在的現(xiàn)象。這種脫靶效應(yīng)已經(jīng)通過不同的體內(nèi)和體外方法進(jìn)行了徹底分析[8-9，25]，主要是由于sgRNA的識別序列與非靶點DNA發(fā)生了局部匹配，主要原因有：(1)一般情況下，sgRNA不能識別和編輯任何鄰近PAM的非靶點DNA位點(長度為10～12 bp)，發(fā)生堿基錯配，且不能識別3個以上的非靶點DNA位點。經(jīng)典的通過體外篩選結(jié)合高通量測序的方法檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)在HEK293T細(xì)胞的脫靶情況的研究表明，Cas9的sgRNA有多達(dá)5個錯配[25]。(2)當(dāng)脫靶位點DNA序列長度比sgRNA多或少幾個堿基時會形成DNA凸起或RNA凸起，從而完成其他堿基的正確配對。即使脫靶位點DNA序列長度比sgRNA的識別序列的長度差5 bp，仍能通過形成多個凸起的形式進(jìn)行堿基配對并介導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行DNA切割[26]。

2.1CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的影響因素

2.1.1sgRNA 雖然Cas9的靶點特異性地被sgRNA的20nt引導(dǎo)的序列區(qū)嚴(yán)格控制著，但幾項初步研究表明，sgRNA鄰近PAM的10～12 bp的堿基配對更能決定Cas9的靶點特異性，并且通常比其余的向?qū)NA(gRNA)序列更重要[2，18]。此外，sgRNA的GC含量也與特異性密切相關(guān)。在一項CRISPR/Cas9介導(dǎo)誘變的研究中觀察到，sgRNAs的PAM序列的最近端區(qū)域其誘變效率與GC含量呈正相關(guān)[27]。研究表明，在最接近PAM序列的6個堿基對的序列中，具有至少4個GC的sgRNA具有超過60%的可遺傳突變率，這提示可以根據(jù)PAM附近序列的GC含量選擇有效的sgRNA。

2.1.2PAM CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行切割的必要條件就是PAM序列區(qū)，也就是說即使靶點序列與sgRNA序列完全匹配，如果沒有PAM序列，Cas9也不能進(jìn)行切割[28]，而DNA的切割效率也取決于PAM序列[29]。NGG(N可為A，T，C或G)是PAM的既定序列。然而，最近的研究表明，盡管與NGG相比只有約五分之一的結(jié)合效率，Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)也可以使用NRG(其中R為G或A)作為PAM序列。幾項研究報道，NRG序列是人EMX基因座中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的DNA切割的主要非既定PAM[9，30]。PAM序列中每個堿基的結(jié)合頻率不同。第1個核苷酸是最不固定的，其中G在接近50%的結(jié)合位點，而第2個位置，G在大于90%的結(jié)合位點[9，31]，表明NRG不是CRISPR/Cas9序列設(shè)計的最佳PAM。因此，NRG PAM序列對Cas9 DNA切割的確切作用在很大程度上尚不清楚[32]。

2.1.3Cas9蛋白和其他因素 研究顯示，將純化的Cas9蛋白和sgRNA直接輸送到細(xì)胞中，可導(dǎo)致脫靶效應(yīng)降低，這是因為Cas9-sgRNA核糖核蛋白復(fù)合物在分娩后幾乎立即切割染色體DNA并在細(xì)胞中迅速降解[33-34]。脫靶效應(yīng)還可能與細(xì)胞型特異性有關(guān)，并且高度取決于特定細(xì)胞類型的DNA雙鏈斷裂(DBS)修復(fù)途徑的完整性[35]。此外，CpG位點的DNA甲基化也可能會阻礙Cas9在細(xì)胞中的結(jié)合效率[36]。

2.2降低脫靶效應(yīng)的策略

2.2.1改變sgRNA序列 通過截短sgRNA的3′末端、縮短與sgRNA的5′末端的靶點互補(bǔ)區(qū)域3nt或添加2個鳥嘌呤核苷酸到sgRNA的5′末端，可以大大降低脫靶反應(yīng)，并可在一些脫靶位點減少約5 000倍突變的可能[25，37]。同時，RNA引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶(RNA-guided endonuclease，RGEN)使用這些改變的sgRNA也可以降低脫靶效應(yīng)。

2.2.2控制Cas9/sgRNA復(fù)合物的濃度 如果增加轉(zhuǎn)染的DNA量，則增加了Cas9/sgRNA復(fù)合物的濃度，雖然增加了正確靶點的結(jié)合率，但也增加了脫靶效應(yīng)；如果減少轉(zhuǎn)染的DNA的量，則減少了Cas9/sgRNA復(fù)合物的濃度，通過增加靶點專一性導(dǎo)致靶內(nèi)切割減少，即脫靶效應(yīng)減少，但正確靶點的結(jié)合率也隨之降低[38]。因此，必須考慮靶內(nèi)切割效率和脫靶效應(yīng)之間的平衡。所以未來對Cas9和sgRNA的優(yōu)化設(shè)計需要考慮在提高Cas9特異性的同時而不犧牲靶內(nèi)切割效率[9，25，39]。

2.2.3應(yīng)用雙切口措施 盡管可以設(shè)計高度特異性的sgRNA，但是Cas9的脫靶活性卻降低了其靶向位點的數(shù)量，為了克服這個缺陷，有研究者將Cas9蛋白修飾得到其突變型D10ACas9切口酶(Cas9n)，Cas9n替換野生型Cas9蛋白[40-41]。這些Cas9n需要一對sgRNA編輯1個位點，由于Cas9n只有1個結(jié)構(gòu)域，只能通過切割DNA單鏈產(chǎn)生1個切口，因此Cas9n會在每個sgRNA結(jié)合的位置形成單鏈切口，兩個相鄰的單鏈切口會引起DBS，DBS形成后細(xì)胞會進(jìn)行修復(fù)。而在脫靶位點處，單鏈切口則無法形成DBS。因此，該方法在保持基因切割效率的同時，具有最小程度的脫靶效應(yīng)。目前，該方法已經(jīng)被其他許多實驗室廣泛應(yīng)用[39-40，42]。

2.2.4fCas9系統(tǒng) 為了進(jìn)一步提高DNA的切割特異性，研究者已經(jīng)合成了具有FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域(fCas9)的無催化活性的Cas9(dCas9)的融合物(FokI-dCas9)，F(xiàn)okI-dCas9編輯目標(biāo)DNA位點的特異性比野生型Cas9高140倍以上[43-44]。fCas9系統(tǒng)要求當(dāng)兩個FokI-dCas9彼此靠近形成二聚體時才可進(jìn)行DNA切割。該方法在很大程度上降低了非靶向位點的DNA切割[44]。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的ncRNA編輯在人類癌癥中的應(yīng)用

3.1CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的微RNA(miRNA)編輯 目前，許多研究已經(jīng)表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)是ncRNA相關(guān)基因組編輯或調(diào)控的最佳選擇[45-52]。miRNA作為主要的ncRNA之一在CRISPR/Cas9相關(guān)領(lǐng)域已被廣泛研究。CHANG等[45]證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在初級miRNA結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生的改變可導(dǎo)致成熟的miRNA在體內(nèi)和體外下調(diào)，同時，這項研究還表明正確設(shè)計CRISPR/Cas9中sgRNA可顯著將同一家族中具有高度保守序列的miRNA的脫靶效應(yīng)最小化。ZHOU等[53]的研究中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功敲除了肝癌細(xì)胞系中的miRNA-3188，發(fā)現(xiàn)miRNA-3188 KO能有效地抑制細(xì)胞生長、侵襲和遷移，并抑制裸鼠中的異種移植物腫瘤生長。另一項研究表明，慢病毒CRISPR/Cas9載體在將插入和缺失引入前體miRNA序列中是高效的，通過使用該方法研究者成功地破壞了miRNA-21的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)前體miRNA-21序列的破壞可導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的減少。除了編輯或調(diào)節(jié)上述的miRNA之外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在各種癌細(xì)胞或生物體中也顯示出對其他miRNA如miRNA-137、miRNA-93、miRNA-309、miRNA-126a/b等的廣泛應(yīng)用[47-51]。

3.2CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的長鏈非編碼RNA(IncRNA)編輯 除了miRNA之外，另一種主要調(diào)控多種生物學(xué)過程的ncRNA，即IncRNA已經(jīng)被CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功調(diào)控。尿路上皮癌抗原1(UCA1)是膀胱癌中上調(diào)的IncRNA，可以通過特定設(shè)計的CRISPR/Cas9的gRNA來靶向，并在體內(nèi)和體外有效地被抑制[54]。可見，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可調(diào)節(jié)IncRNA的表達(dá)，并可為臨床治療癌癥提供新方法。微小的基因的缺失或插入可能不一定使某個非編碼基因的功能喪失，這可能是將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于非編碼基因的限制之一。為了克服這個障礙，HO等[55]采用同源重組技術(shù)，將標(biāo)記基因整合到基因組中，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地將UCA1、IncRNA-21及AK023948分別在HTC-116和MCF-7細(xì)胞中敲除。在SHECHNER等[56]的研究中，研究者開發(fā)了CRISPR-Display(CRISP-Disp)法，一種使用Cas9將大分子RNA載體部署到DNA基因座的有目標(biāo)性的定位方法，研究者發(fā)現(xiàn)至少長4.8 bp的功能性RNA結(jié)構(gòu)域可以插入CRISPR gRNA的多個位點中，從而允許構(gòu)建具有天然lncRNA的Cas9復(fù)合物，這種方法可能為癌癥領(lǐng)域中的IncRNA研究開辟一條途徑。

4 小 結(jié)

目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為第3代基因編輯技術(shù)，由于其經(jīng)濟(jì)、易操作，研究者們可以在其工作包中通過獲得更好的選擇而輕松地編輯感興趣的基因組等優(yōu)點已成為科學(xué)界的研究熱點。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢不言而喻，但它仍面臨著許多問題與挑戰(zhàn)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)可能會是造成不良遺傳改變的原因，從而導(dǎo)致癌癥或其他棘手的問題，成為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的瓶頸。雖然研究者們已經(jīng)投入了很多努力改進(jìn)對脫靶效應(yīng)的預(yù)測和降低脫靶效應(yīng)，但為了能更精確有效地編輯目標(biāo)序列，需要研究者們開發(fā)更多的技術(shù)和算法。以往地研究認(rèn)為，脫靶效應(yīng)是一個不常見的現(xiàn)象，然而SCHAEFER等[24]的研究表明脫靶效應(yīng)是廣泛存在的，盡管這個觀點對以往的結(jié)論提出了挑戰(zhàn)，但這不是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的危機(jī)，相反，這是研究者在使用新技術(shù)時檢測脫靶效應(yīng)的助力。

倫理問題是研究者在實際應(yīng)用CRISPR/Cas9相關(guān)技術(shù)之前無法避免的問題。迄今為止，大多數(shù)國家都允許研究者編輯基因組，用于提高糧食產(chǎn)量其他生物用途。然而，關(guān)于操縱人類的卵子和精子等仍然非常具有爭議。首先，CRISPR/Cas9技術(shù)仍是一個尚不成熟的基因編輯技術(shù)，遺傳改造對后代的長期影響知之甚少，一旦發(fā)生錯誤或脫靶效應(yīng)，將導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。其次，CRISPR/Cas9技術(shù)可以編輯想要的任何基因組，如果將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于反進(jìn)化和反人類，將會帶來巨大的社會沖突。盡管存在分歧，但筆者樂觀地認(rèn)為，研究者將會就這個問題與倫理學(xué)家和法律達(dá)成共識。

盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍然存在各種各樣的局限性和障礙，但相信將來隨著技術(shù)的逐漸成熟，能夠有助于藥物發(fā)現(xiàn)、癌癥治療及基因疾病的治愈。

[1]MALI P，YANG L，ESVELT K M，et al．RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]．Science，2013，339(6121)：823-826．

[2]CONG L E，RAN F A，COX D，et al．Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]．Science，2013，339(6121)：819-823.

[3]FELLMANN C，GOWEN B G，LIN P C，et al．Cornerstones of CRISPR-Cas in drug discovery and therapy[J]．Nat Rev Drug Discov，2017，16(2)：89-100.

[4]ZHUO C，HOU W，HU L，et al．Genomic editing of non-coding RNA genes with CRISPR/Cas9 ushers in a potential novel approach to study and treat schizophrenia[J]．Front Mol Neurosci，2017，10：28．

[5]CANVER M C，BAUER D E，ORKIN S H．Functional interrogation of non-coding DNA through CRISPR genome editing[J]．Methods，2017(121/122)：118-129．

[6]MALI P，AACH J，STRANGES P B，et al．CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering[J]．Nat Biotechnol，2013，31(9)：833-838．

[7]HSU P D，SCOTT D A，WEINSTEIN J A，et al．DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J]．Nat Biotechnol，2013，31(9)：827-832.

[8]JEMAL A，BRAY F，CENTER M M，et al．Global cancer statistics[J]．CA Cancer J Clin，2011，61(2)：69-90.

[9]STUPP R，HEGI M E，MASON W P，et al．Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase Ⅲ study:5-year analysis of the EORTC-NCIC trial[J]．Lancet Oncol，2009，10(5)：459-466.

[10]PABO C O，PEISACH E，GRANT R A．Design and selection of novel Cys2His2 Zinc finger proteins[J]．Annu Rev Biochem，2001，70：313-340.

[11]BOCH J，SCHOLZE H，SCHORNACK S，et al．Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors[J]．Science，2009，326(5959)：1509-1512.

[12]MOSCOU M J，BOGDANOVE A J．A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors[J]．Science，2009，326(5959)：1501．

[13]VAN DER OOST J．Molecular biology.New tool for genome surgery[J]．Science，2013，339(6121)：768-770.

[14]FINERAN P C，CHARPENTIER E．Memory of viral infections by CRISPR-Cas adaptive immune systems:acquisition of new information[J]．Virology，2012，434(2)：202-209.

[15]ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al．Nucleotide sequence of the iap gene,responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli,and identification of the gene product[J]．J Bacteriol，1987，169(12)：5429-5433．

[16]HAFT D H，SELENGUT J，MONGODIN E F，et al．A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes[J]．PLoS Comput Biol，2005，1(6)：e60．

[17]MAKAROVA K S，HAFT D H，BARRANGOU R，et al．Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems[J]．Nat Rev Microbiol，2011，9(6)：467-477.

[18]JINEK M，CHYLINSKI K，F(xiàn)ONFARA I，et al．A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]．Science，2012，337(696)：816-821.

[19]JINEK M，EAST A，CHENG A，et al．RNA-programmed genome editing in human cells[J]．Elife，2013，2(2)：e00471.

[20]DELTCHEVA E，CHYLINSKI K，SHARMA C M，et al．CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase Ⅲ[J]．Nature，2011，471(7340)：602-607.

[21]BROUNS S J，JORE M M，LUNDGREN M A，et al．Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes[J]．Science，2008，321(5891)：960-964.

[22]WOLLEBO H S，BELLIZZI A，KAMINSKI R，et al．CRISPR/Cas9 system as an agent for eliminating polyomavirus JC infection[J]．PLoS One，2015，10(9)：e0136046．

[23]YANG L，GRISHIN D，WANG G，et al．Targeted and genome-wide sequencing reveal single nucleotide variations impacting specificity of Cas9 in human stem cells[J]．Nat Commun，2014，5：5507.

[24]SCHAEFER K A，WU W H，COLGAN D F，et al．Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo[J]．Nat Methods，2017，14(6)：547-548.

[25]PATTANAYAK V，LIN S，GUILINGER J P，et al．High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity[J]．Nat Biotechnol，2013，31(9)：839-843.

[26]LIN Y，CRADICK T J，BROWN M T，et al．CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences[J]．Nucleic Acids Res，2014，42(11)：7473-7485.

[27]沈崇靈．現(xiàn)代西方法理學(xué)[M]．北京：北京大學(xué)出版社,1994:51-52．

[28]STERNBERG S H，REDDING S，JINEK M，et al．DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9[J]．Nature，2014，507(7490)：62-67.

[29]鄭武，谷峰．CRISPR/Cas9的應(yīng)用及脫靶效應(yīng)研究進(jìn)展[J]．遺傳，2015，37(10)：1003-1010．

[30] JIANG W，BIKARD D，COX D，et al．RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems[J]．Nat Biotechnol，2013，31(3)：233-239．

[31]KUSCU C，ARSLAN S，SINGH R，et al．Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease[J]．Nat Biotechnol，2014，32(7)：677-683．

[32]ZHANG Y，GE X，YANG F，et al．Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells[J]．Sci Rep，2014，4：5405．

[33]KIM S，KIM D，CHO S W，et al．Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins[J]．Genome Res，2014，24(6)：1012-1019．

[34]RAMAKRISHNA S，KWAKU DAD A B，BELOOR J，et al．Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA[J]．Genome Res，2014，24(6)：1020-1027．

[35]DUAN J，LU G，XIE Z，et al．Genome-wide identification of CRISPR/Cas9 off-targets in human genome[J]．Cell Res，2014，24(8)：1009-1012．

[36]YU C，LIU Y，MA T，et al．Small molecules enhance CRISPR genome editing in pluripotent stem cells[J]．Cell Stem Cell，2015，16(2)：142-147．

[37]PAULIS M，CASTELLI A，LIZIER M，et al．A pre-screening FISH-based method to detect CRISPR/Cas9 off-targets in mouse embryonic stem cells[J]．Sci Rep，2015，5：12327．

[38]尹珅，賀桂芳，賴方秾，等．CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)[J]．生物技術(shù)通報，2016，32(3)：31-37．

[39]FU Y，F(xiàn)ODEN J A，KHAYTER C，et al．High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells[J]．Nat Biotechnol，2013，31(9)：822-826．

[40]RAN F A，HSU P D，LIN C Y，et al．Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity[J]．Cell，2013，154(6)：1380-1389.

[41]TREVINO A E，ZHANG F．Genome editing using Cas9 nickases[J]．Methods Enzymol，2014，546：161-174．

[42]SHEN B，ZHANG W，ZHANG J，et al．Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects[J]．Nat Methods，2014，11(4)：399-402．

[43]GUILINGER J P，THOMPSON D B，LIU D R．Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification[J]．Nat Biotechnol，2014，32(6)：577-582.

[44]TSAI S Q，WYVEKENS N，KHAYTER C，et al．Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing[J]．Nat Biotechnol，2014，32(6)：569-576.

[45]CHANG H，YI B，MA R，et al．CRISPR/cas9,a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo[J]．Sci Rep，2016，6：22312．

[46]HUO W，ZHAO G，YIN J，et al．Lentiviral CRISPR/Cas9 vector mediated miR-21 gene editing inhibits

the epithelial to mesenchymal transition in ovarian cancer cells[J]．J Cancer，2017，8(1)：57-64．

[47]LI X，CHEN W，ZENG W，et al．MicroRNA-137 promotes apoptosis in ovarian cancer cells via the regulation of XIAP[J]．Br J Cancer，2017，116(1)：66-76．

[48]ZHANG Y，ZHAO B，ROY S，et al．MicroRNA-309 targets the homeobox gene SIX4 and controls ovarian development in the mosquito aedes aegypti[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2016，113(33)：E4828-4836．

[49]CHEN J，ZHU R F，LI F F，et al．MicroRNA-126a directs lymphangiogenesis through interacting with chemokine and Flt4 signaling in zebrafish[J]．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2016，36(12)：2381-2393．

[50]NARAYANAN A，HILL-TERAN G，MORO A，et al．In vivo mutagenesis of miRNA gene families using a scalable multiplexed CRISPR/Cas9 nuclease system[J]．Sci Rep，2016，6：32386．

[51]WALLACE J，HU R，MOSBRUGER T L，et al．Genome-wide CRISPR-Cas9 screen identifies microRNAs that regulate myeloid leukemia cell growth[J]．PLoS One，2016，11(4)：e0153689．

[52]HO T T，ZHOU N，HUANG J，et al．Targeting non-coding RNAs with the CRISPR/Cas9 system in human cell lines[J]．Nucleic Acids Res，2015，43(3)：e17．

[53]ZHOU S J，DENG Y L，LIANG H F，et al．Hepatitis B virus X protein promotes CREB-mediated activation of miR-3188 and Notch signaling in hepatocellular carcinoma[J]．Cell Death Differ，2017，24(9)：1577-1587．

[54]ZHEN S，HUA L，LIU Y H，et al．Inhibition of long non-coding RNA UCA1 by CRISPR/Cas9 attenuated malignant phenotypes of bladder cancer[J]．Oncotarget，2017，8(6)：9634-9646．

[55]HO T T，ZHOU N，HUANG J，et al．Targeting non-coding RNAs with the CRISPR/Cas9 system in human cell lines[J]．Nucleic Acids Res，2015，43(3)：e17.

[56]SHECHNER D M，HACISULEYMAN E，YOUNGER S T，et al．Multiplexable,locus-specific targeting of long RNAs with CRISPR-display[J]．Nat Methods，2015，12：664-670.