楊 飛

（遼寧省錦州市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000）

感染性腹瀉是由寄生蟲或各種微生物及其產(chǎn)物所引起的常見腸道傳染病，而小腸結(jié)腸炎耶爾森菌為一種重要的感染性腹瀉致病菌，其為革蘭染色進(jìn)行小桿菌或球桿菌，主要經(jīng)糞-口途徑進(jìn)入人體，人類感染該菌后潛伏期為攝食后3～7 d，病程一般為1～3 d，主要表現(xiàn)為急性胃腸炎的癥狀以及腸道外感染，嚴(yán)重影響患者的生命健康[1-2]。因此，提高小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢出率，并了解其分布特征對臨床疾病的防治有重要指導(dǎo)性意義[3]。本研究中通過資料回顧性分析，探討不同檢測方法檢驗(yàn)耶爾森菌感染者的臨床價(jià)值，現(xiàn)作以下報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取50例于2014年5月至2015年5月我單位接收的腹瀉患者，均符合感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS271-2007），患者表現(xiàn)為糞便形狀發(fā)生改變，每日排便次數(shù)不低于3次。50例患者中，女22例，男28例，年齡5個(gè)月～70歲，平均（32.49±8.53）歲。

1.2 檢測方法與判斷標(biāo)準(zhǔn)：采集患者新鮮糞便，置于干燥、潔凈無吸水性的有蓋容器內(nèi)，并保證不混有水、尿液等雜質(zhì)。之后，分別采用RT-PCR法和培養(yǎng)法對樣本中耶爾森菌感染情況進(jìn)行檢測。培養(yǎng)：取0.5 g糞便樣本置于Cary-Blair保存液內(nèi)，并加入45 mL生理鹽水，于16 ℃增菌液內(nèi)放置并進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間為18 h。18 h后于CIN平板上取5 μL進(jìn)行接種，再在25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h，予以可疑菌落培養(yǎng)、初篩，根據(jù)生化試驗(yàn)結(jié)果及初篩結(jié)果進(jìn)行陰性判定，采用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陽性對照。陰性判定標(biāo)準(zhǔn)：不具備陽性菌株的生化反應(yīng)；陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：具有與標(biāo)準(zhǔn)菌株相同的生化反應(yīng)。RT-PCR法：取0.5 g糞便樣本于16 ℃環(huán)境下培養(yǎng)18 h后取，取200 μL予以DNA提取，反應(yīng)溫度設(shè)置為95 ℃，產(chǎn)物擴(kuò)增長度為154bp，并設(shè)立對照組，以反應(yīng)前后熒光差值作為主要衡量標(biāo)準(zhǔn)。陰性判定標(biāo)準(zhǔn)：樣品擴(kuò)增后未出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶；陽性：樣品擴(kuò)增后出現(xiàn)預(yù)期大小條帶。

1.3 觀察指標(biāo)：觀察兩種檢測方法對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測情況，并做比較分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS15.0軟件分析及及處理數(shù)據(jù)，以百分比（%）表示計(jì)數(shù)資料，當(dāng)P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間數(shù)據(jù)以卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

RT-PCR法對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽性檢出率為12%，較培養(yǎng)法小腸結(jié)腸炎耶爾森菌4%的陽性檢出率明顯更高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=4.348，P＜0.05），見表1。

3 討 論

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種重要的感染性腹瀉致病菌，人類感染該菌后，主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、發(fā)熱等急性胃腸炎癥狀，還可引起活動(dòng)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、耶氏肝炎，還有心肌炎、敗血癥、腦膜炎及創(chuàng)傷感染等腸道外癥狀，甚至還能由超抗原引起自身免疫性疾病，因此該菌越來越受到全球范圍內(nèi)人們的普遍重視，且多將該菌列為進(jìn)出口食品的常規(guī)檢測項(xiàng)目[4]。雖然大部分患者主要表現(xiàn)為自限性的腹瀉，但該菌極易侵犯腸系膜淋巴結(jié)，使患者成為慢性攜帶者及潛在的傳染源，再加上該菌所特有的超抗原可引發(fā)關(guān)節(jié)炎、敗血癥、甲狀腺疾病等腸外癥狀，對人類的健康造成極大威脅。對耶爾森菌感染進(jìn)行及時(shí)正確診斷，以便進(jìn)行臨床方案的制定，有賴于準(zhǔn)確、快速、簡便檢測方法的建立。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該菌在我國的分布非常廣泛，但既往人們對該菌的檢出率不高，原因是采取的是分離培養(yǎng)聯(lián)合生化鑒定方法檢測該菌，而耶爾森菌培養(yǎng)增殖緩慢，分離成功率低[5]。

表1 兩種檢測方法對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢出率的比較[n（%）]

目前臨床上檢驗(yàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌常使用的方法為RT-PCR和培養(yǎng)法，其中培養(yǎng)法操作簡單，是一種采用人工方法使細(xì)菌生長繁殖的技術(shù)，其成本低，設(shè)備投入少，對檢驗(yàn)人員的素質(zhì)要求底，并且該技術(shù)在操作過程中可進(jìn)行精確調(diào)控，但其也有一定的缺陷，具體有以下幾方面[6]：①無菌操作嚴(yán)格，該檢測方法在培養(yǎng)過程中需嚴(yán)重執(zhí)行無菌操作，否則一旦標(biāo)本受外界細(xì)菌的污染，會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果；②耗時(shí)耗力，不易自動(dòng)化，可能會(huì)延誤對疾病的治療以及及時(shí)有效的預(yù)防控制措施的實(shí)施，故該技術(shù)對于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查往往不適用。RT-PCR法結(jié)合cDNA聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）和RNA反轉(zhuǎn)錄（RT）雙重技術(shù)的生化技術(shù)，其主要原則在于利用相關(guān)技術(shù)對細(xì)胞或組織中的總RNA進(jìn)行提取，并以其中的mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄呈cDNA，之后行PCR擴(kuò)增，而檢測基因表達(dá)或獲得目的基因。其在細(xì)菌檢驗(yàn)中，靈敏度高，特異性強(qiáng)，在該技術(shù)下能分離出高質(zhì)量的RNA，不含反轉(zhuǎn)錄沒的抑制劑且保證全長，進(jìn)而成功合成cDNA，提高檢出的特異度及靈敏度；該技術(shù)檢測快速，可使監(jiān)測鑒定所耗費(fèi)的時(shí)間大大縮短；不易污染；能通過微量的物質(zhì)得到不少的目的片段，是對樣品進(jìn)行定量及定性分析。本研究中通過資料回顧性分析結(jié)果顯示，RT-PCR法對耶爾森菌的檢出率較培養(yǎng)法顯著要高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.05），分別為，可見RT-PCR檢測法對耶爾森菌的檢出效果更好，同時(shí)其還能對檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析，以便于臨床醫(yī)師更好地掌握患者感染情況，并給予合理的治療。但該技術(shù)也存在一定的缺陷，具體有以下幾方面：①對操作人員技術(shù)素質(zhì)要求較高；②檢驗(yàn)試驗(yàn)中容易出現(xiàn)假陰性及假陽性，得到的片段可能并非目的片段；③其需要的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備昂貴，檢測成本高，使其不適用于基層單位推廣普遍使用及現(xiàn)場快速檢測。綜上所述，RT-PCR檢測法對腹瀉糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢出效果更好，以便及時(shí)予以抗感染治療，對改善患者預(yù)后具有更高的臨床意義，建議在臨床推廣應(yīng)用。

[1] 周旭.腹瀉糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢驗(yàn)的價(jià)值結(jié)果分析[J].中國醫(yī)藥指南,2014,12(14)：102-103.

[2] 張景艷,榮幸,張永旭,等.腹瀉糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢驗(yàn)的價(jià)值分析[J].中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理,2016,7(7)：161-162.

[3] 符倚川,趙艷,高運(yùn)安,等.兩種方法檢驗(yàn)腹瀉糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的結(jié)果比較[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2016,33(9)：1823-1824.

[4] 姜曉梅,李剛山,王意銀,等.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分離鑒定及毒力基因檢測[J].西南國防醫(yī)藥,2015,25(8)：844-846.

[5] 鄭書發(fā),余斐,陳曉,等.2009-2014年浙江省哨點(diǎn)醫(yī)院急性腹瀉患者病原監(jiān)測研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2016,50(12)：1084-1090.

[6] 沈麗珍,陳素菜,張愛鳴,等.感染性腹瀉患者病原菌分布與耐藥性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2015,25(23)：533-534.