王麗娜 吳翠松 陳薇薇

（江蘇大學(xué)附屬鎮(zhèn)江三院艾滋病科，江蘇 鎮(zhèn)江 212005）

艾滋?。ˋIDS）是一種獲得性免疫缺陷綜合征，因較高傳染性和不可治愈性引起極高的關(guān)注。艾滋病患者會(huì)出現(xiàn)的各種嚴(yán)重并發(fā)癥及腫瘤，預(yù)后極差，使其成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前已經(jīng)影響到了國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和全社會(huì)穩(wěn)定[1]。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time fluorescener）方法將艾滋病患者與正常對(duì)照者糞便中的五種細(xì)菌進(jìn)行定量檢測(cè)，與正常對(duì)照組進(jìn)行比較，分析腸道菌群變化的差異，為臨床診療進(jìn)行治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 觀察組：2010年1月至2016 年1月鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院診治的急性感染期、無(wú)癥狀期、艾滋病期患者大便標(biāo)本各10份，共30例，男性22例，女性8例，年齡19～56歲，平均年齡 （36.05±8.93）歲，糞便采樣前4周內(nèi)未使用抗生素或微生態(tài)制劑；其C淋巴細(xì)胞數(shù)在（0～676）×106/L，并且無(wú)慢性腹瀉癥狀。

1.1.2 對(duì)照組：正常對(duì)照組30例，男性例22，女性8例，年齡18～54歲，平均年齡 （33.13±8.73）歲。來(lái)源于觀察組的配偶或工友共30例。均無(wú)胃腸道疾病史，留取糞便標(biāo)本前4周內(nèi)未使用微生態(tài)制劑或/和抗菌藥物。

1.2 研究材料

1.2.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)細(xì)菌的ddl基因序列設(shè)計(jì)糞腸球菌及屎腸球菌的特異性引物；根據(jù)細(xì)菌的16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬和大腸桿菌的特異性引物。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、熒光染料等。

1.2.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀、電泳儀等。

1.3 方法：留取自然排便的新鮮糞便，取回實(shí)驗(yàn)室，用天平秤取每份100 mg，按實(shí)驗(yàn)要求處理后，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提供的說(shuō)明提取正常對(duì)照組及艾滋病患者的糞便細(xì)菌DNA[2]。

1.3.1 依據(jù)正常對(duì)照者糞便基因組DNA來(lái)制作五種菌群的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，應(yīng)用PCR方法對(duì)細(xì)菌引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物按DNA純化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行純化，測(cè)定純化產(chǎn)物A值及濃度，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.2 將待測(cè)糞便樣品中提取的DNA分別進(jìn)行5種細(xì)菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，根據(jù)反應(yīng)溶解曲線(xiàn)分析產(chǎn)物的特異性，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，兩組間一致性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 用擴(kuò)增曲線(xiàn)來(lái)表示不同拷貝數(shù)的模板循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度關(guān)系，二者關(guān)系呈S形，分為基數(shù)期、對(duì)數(shù)期及平臺(tái)期3個(gè)階段。其中對(duì)數(shù)期是熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，細(xì)菌的定量分析在這個(gè)階段進(jìn)行。

2.2 以對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，作為待測(cè)樣品的定量檢測(cè)的參照標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 通過(guò)溶解曲線(xiàn)反向驗(yàn)證引物的特異性，以上5種細(xì)菌的溶解曲線(xiàn)均為單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物單一。

2.4 糞便細(xì)菌定量檢測(cè)結(jié)果：AIDS/HIV患者糞便中的雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬數(shù)量顯著少于正常對(duì)照組，P＜0.05；而糞腸球菌、大腸桿菌和屎腸球菌的數(shù)量則顯著高于正常對(duì)照組，P＜0.05。見(jiàn)表1。

3 討 論

腸道是人體內(nèi)細(xì)菌密度最大的部位，腸道內(nèi)正常菌群之間互相依賴(lài)、制約形成腸道微環(huán)境，是人體最重要的微環(huán)境。人體絕大部分的淋巴組織及細(xì)胞定位于腸道組織內(nèi)。約40%的總T細(xì)胞位于腸黏膜上皮內(nèi)。因此腸道成為HIV感染早期病毒復(fù)制的靶點(diǎn)[3]，也是CD4

+T細(xì)胞遭受破壞的主要部位。故消化道是HIV感染過(guò)程中最常發(fā)生并發(fā)癥的系統(tǒng)之一。雙歧桿菌是專(zhuān)性厭氧菌，占腸道總菌量的99%，具有免疫調(diào)節(jié)也營(yíng)養(yǎng)的作用，大腸桿菌、糞腸球菌等兼性厭氧菌占腸道菌群的百分之一，在正常生理狀態(tài)下不致病。一旦平衡遭到破壞，微生態(tài)失調(diào)即可造成感染[4]。幾乎所有AIDS/HIV患者都存在不同程度的免疫缺陷；病毒攻擊腸道中的T細(xì)胞，腸壁屏障功能受損，腸道敏感菌被抑制，而未被抑制的條件制致病菌如糞球菌、大腸桿菌等大量繁殖，引起菌群失調(diào)；釋放的內(nèi)毒素移位，促進(jìn)腸源性感染的發(fā)生與發(fā)展[5]，引發(fā)全身多器官功能衰竭。本實(shí)驗(yàn)通對(duì)AIDS/HIV患者腸道內(nèi)五種細(xì)菌的定量，與正常對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示AIDS/HIV患者糞便中雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量顯著下降，而大腸桿菌、糞腸球菌及屎腸球菌數(shù)量明顯增多。從而說(shuō)明AIDS/HIV患者腸黏膜屏障受到攻擊破壞后，腸道內(nèi)的雙歧桿菌、乳酸菌急劇減少；大腸桿菌、糞腸球菌和屎腸球菌得以大量繁殖，發(fā)生細(xì)菌移位，導(dǎo)致全身感染，最終不可控制，出現(xiàn)多器官衰竭，同時(shí)還有可能導(dǎo)致其他疾病的發(fā)生，如卡波西肉瘤、惡性淋巴瘤、子宮頸癌[6]。隨著對(duì)AIDS/HIV患者腸道微生態(tài)研究的不斷深入，目前已取得了一定的進(jìn)展，為臨床預(yù)防及診治提供了可靠地參考。

表1 糞便標(biāo)本細(xì)菌定量檢測(cè)結(jié)果（-x±s，n=30）

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)艾滋病組.艾滋病診療指南[J].中華傳染病雜志,2011,29(10)：629-640.

[2] 郭世奎,王昆華,龔昆梅,等.結(jié)直腸癌患者糞便DNA提取方法的比較[J].云南醫(yī)藥,2009,30(5)：520-523.

[3] 張琳萄,夏雪山,鄭永唐.艾滋病獼猴模型的腸道病理學(xué)研究進(jìn)展[J].免疫學(xué)雜志,2015,28(3)：265-276.

[4] 吳建軍,曾清,溫廣德.雙歧桿菌四聯(lián)活菌治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎的臨床療效觀察[J].現(xiàn)代消化及介入診療,2010,15(2)：116-117.

[5] Magnotti LJ,Deiteh EA.Burns,bacterial translocation,gutbarrier function,and failure [J].Bum Care Rehabil,2005,26(5)：383-391.

[6] KOIKE M,Masuda A,Ichikawa K,et al.Plasmablastic lasmablastic lymphoma of the duodenal and jejunum[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(7)：4479-4483.