李 軍，董 彬，張 超，付建新，胡紹慶，趙宏波

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州311300；2.浙江理工大學(xué) 建筑工程學(xué)院，浙江 杭州310000）

桂花Osmanthus fragrans在中國栽培歷史悠久，栽培區(qū)域廣闊，是中國最重要的集綠化、美化和香化為一體的傳統(tǒng)名花和園林樹種之一［1-2］。桂花野生資源豐富，現(xiàn)已明確的有150多個(gè)品種［3-4］，這為桂花種質(zhì)創(chuàng)新和新品種的選育提供了豐富的遺傳變異和優(yōu)異的基因庫［5］。分子標(biāo)記是進(jìn)行品種鑒定和親緣關(guān)系分析、分子輔助育種、遺傳多樣性和繁育系統(tǒng)研究等最常用的技術(shù)手段，通常需要有共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物，因此引物開發(fā)顯得極其重要［6］。簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats,SSR）是由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列［7］，目前，已經(jīng)報(bào)道的桂花SSR引物十分有限，僅ZHANG等［8］開發(fā)了29對桂花SSR引物，馬寅峰［9］經(jīng)過篩選獲得20對具有多態(tài)性的SSR引物，急需開發(fā)更多的特異性和多態(tài)性高的SSR引物用于桂花遺傳分析和品種鑒定等相關(guān)研究。表達(dá)序列標(biāo)簽-簡單重復(fù)序列（expressed sequence tag SSR，EST-SSR）技術(shù)可避免基因組SSR開發(fā)過程中需要構(gòu)建基因組DNA文庫等繁瑣步驟，可為功能基因提供可靠的標(biāo)記，能夠充分反映基因組功能區(qū)域的相似程度。目前，EST-SSR標(biāo)記也成為了遺傳多樣性和品種親緣關(guān)系研究的重要手段［10］。最優(yōu)的SSR-PCR反應(yīng)體系和條件，對樣本DNA所擴(kuò)增條帶的數(shù)量、清晰度以及穩(wěn)定性甚為重要，進(jìn)而影響條帶多態(tài)性的統(tǒng)計(jì)與分析［11］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是EST-SSR開發(fā)利用的有效資源，本研究首先對桂花SSR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)以不同野生桂花種群為材料，利用桂花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫大量篩選EST-SSR引物，開發(fā)多態(tài)性高的EST-SSR引物，并利用篩選得到的引物進(jìn)行品種鑒定，促進(jìn)EST-SSR標(biāo)記技術(shù)在桂花種質(zhì)資源評價(jià)和保護(hù)、品種鑒定和遺傳多樣性分析等方面的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本包括浙江龍泉、浙江千島湖、福建長汀、福建清流、湖南郴州、湖南株洲、貴州瑞安、江西九江等8個(gè)桂花野生種群，浙江農(nóng)林大學(xué)桂花資源圃地的7個(gè)丹桂品種，以及采自四川農(nóng)科院園藝所的待鑒定品種。所有樣本材料均采集桂花新生枝上第4片完全展開葉，硅膠干燥后，放置-20℃冰箱備用。

SSR-PCR反應(yīng)用的Taq酶，dNTP，鎂離子（Mg2+），PCR緩沖液（buffer），電泳用的10×TBE緩沖液，50×TAE溶液的相關(guān)藥品，無水乙醇，冰乙酸，瓊脂糖，丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，溴酚藍(lán)，6×上樣緩沖液（loading buffer），標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA標(biāo)準(zhǔn)物（marker）等均購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測 本研究采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取桂花DNA［12］，用Nano-Drop1000全自動(dòng)核酸蛋白快速測儀和質(zhì)量濃度為1.2%瓊脂糖凝膠電泳以及紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測DNA純度、濃度和質(zhì)量。從8個(gè)桂花野生種群中隨機(jī)各選取3份樣本DNA作為SSR-PCR反應(yīng)的模板DNA，選擇福建官坊居群中的E4模板DNA用于體系優(yōu)化以減少模板變化影響體系優(yōu)化的效果。將所有模板DNA稀釋到試驗(yàn)所需的100 mg·L-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 正交試驗(yàn)體系優(yōu)化 以桂花E4為DNA模板，在20 μL的PCR體系中，除2 μL 10×PCR緩沖液外，其他因素采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對模板DNA含量、Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶單位數(shù)進(jìn)行5因素4水平梯度試驗(yàn)，共16個(gè)正交設(shè)計(jì)組合（表1），以確定最佳的桂花ESTSSR 反應(yīng)體系［13］。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及凝膠電泳 利用Biometra PCR儀（德國）進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，不同退火時(shí)間（TM）為30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)35；72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用體積分?jǐn)?shù)為8%非變性聚丙烯酰胺凝膠［28 mL雙蒸水，8 mL體積分?jǐn)?shù)為40%丙烯酰胺，4 mL 10×TBE，320 μL體積分?jǐn)?shù)為10%過硫酸銨，40 μL四甲基乙二胺（TEMED）］電泳檢測，以DNA marker B作為參照；電泳儀（北京市六一儀器廠，DYCZ-6C型）電壓160 V，電流200 mA，電泳100min，然后用銀染法顯示擴(kuò)增條帶。小心拆取凝膠后，依次浸入到固定液及染色液中（20 mL體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇，體積分?jǐn)?shù)為0.5%冰乙酸1 mL，硝酸銀0.2 g，蒸餾水180 mL），置于搖床上震蕩染色12～15 min；去離子水漂洗30 s；顯色液（2 g氫氧化鈉，0.04 g四硼酸鈉、0.6 mL甲醛、200 mL蒸餾水）充分震蕩12～15 min，直至條帶完全顯色。利用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果，統(tǒng)計(jì)并分析擴(kuò)增條帶的多態(tài)性。1.2.4 引物篩選 從桂花轉(zhuǎn)錄組EST-SSR引物序列數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)挑選150對引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其詳細(xì)信息參見表2。利用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系和條件，以8份桂花野生種群的基因組DNA作為模板，對150對SSR引物進(jìn)行初次篩選，12 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的有效性檢測；再以24份基因組DNA（3份·種群-1）對初篩獲得的引物進(jìn)行復(fù)篩，80 g·L-1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性檢測，最終獲得多態(tài)性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的SSR引物。

表1 EST-SSR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16（45）Table 1 EST-SSR orthogonal experimental design L16（45）

1.2.5 多態(tài)性引物在品種鑒定中的應(yīng)用 隨機(jī)挑選3對具有顯著多態(tài)性的SSR引物，以浙江農(nóng)林大學(xué)桂花苗圃的7個(gè)丹桂品種為參照，對四川省常見栽培的14份丹桂樣本（SC01～SC14）進(jìn)行品種鑒定（表3）。1.2.6 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)條帶遷移情況統(tǒng)計(jì)目標(biāo)范圍內(nèi)出現(xiàn)的條帶，不同大小的條帶分別用 “A，B，C，D…”進(jìn)行分類標(biāo)記，純合子帶型記為 “AA，BB，CC，DD，…”，雜合子標(biāo)記為 “AB，AC，BD，AD，…”，將帶型數(shù)據(jù)輸入POPGENE 1.32軟件計(jì)算遺傳距離，然后利用SPSS 19.0的歐氏平均聯(lián)接法繪制聚類樹狀圖。

表2 150對隨機(jī)引物信息表Table 2 Random primers information of 150 pairs

表3 品種鑒定材料信息表Table 3 Material information for cultivars

2 結(jié)果與分析

2.1 桂花SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

以O(shè)F6220-2799擴(kuò)增結(jié)果為例，在SSR-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果中，組合8，14，16的擴(kuò)增條帶較弱，其余組合都能擴(kuò)增出較為清晰的條帶，其中組合4的條帶最為明亮（圖1）。參照正交試驗(yàn)各試劑的濃度和用量，最終確定桂花EST-SSR最優(yōu)PCR反應(yīng)體系為：DNA 40 ng，Mg2+2.25 mmol·L-1， 引物 0.3 μmol·L-1，dNTPs 0.3 mmol·L-1， TaqDNA 聚合酶 1.25 ×16.67 nkat， 并加入 2 μL 10 × PCR 緩沖液， 雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至 20 μL。

圖1 正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Amplification results of orthogonal design

2.2 基于桂花轉(zhuǎn)錄組的EST-SSR引物篩選

利用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系和條件，對隨機(jī)選取的150對EST-SSR引物進(jìn)行初步篩選，共有79對引物擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，有效擴(kuò)增率為52.67%，在對應(yīng)的SSR中，最多的為三、六核苷酸和復(fù)合重復(fù)類型，最少的為單核苷酸和四核苷酸重復(fù)類型（表4）。

表4 150對隨機(jī)EST-SSR引物擴(kuò)增情況Table 4 EST-SSR amplification of 150 primers

以8個(gè)不同野生種群的24份桂花基因組DNA為模板，對初篩所獲得的79對引物進(jìn)行復(fù)篩。最終篩選出19對穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的引物，占引物總數(shù)的12.67%，其中，五核苷酸重復(fù)對應(yīng)的引物多態(tài)性最高（25.00%），其次分別為六核苷酸（19.44%）和三核苷酸（16.67%），在單核苷酸和二核苷酸重復(fù)類型中沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性引物（表4）。篩選得到的19對引物中除了OF8091-2000，OF8233-681，OF10275-1164，OF21405-424在種群內(nèi)擴(kuò)增的多態(tài)性條帶不明顯外，其余的15對引物在種群內(nèi)均能夠擴(kuò)增出豐富的多態(tài)性條帶（圖2）。

2.3 多態(tài)性引物在桂花品種鑒定中的應(yīng)用

利用篩選到的多態(tài)性較高的OF8623-1677，OF24299-844，OF28774-2088 3對引物對供試品種進(jìn)行鑒定（表5）。擴(kuò)增結(jié)果顯示：每對引物都可以產(chǎn)生1或2個(gè)等位基因，并且都可以將所有桂花樣本有效區(qū)分，所有已知桂花品種均有各自獨(dú)特的帶型或帶型組合（表6）。

從品種聚類樹狀圖（圖3）可以看出：在相對距離為12的時(shí)候，21份供鑒定樣本可聚為4類。首先，‘上海丹桂’和 ‘橙紅丹桂’分別單獨(dú)聚為一類（Ⅰ和Ⅱ），因?yàn)檫@2個(gè)品種在3對引物中的帶型均比較特別，表現(xiàn)出明顯的差異性；第Ⅲ類中，包含了 ‘朱砂丹桂’和大部分的成都來源的樣本，其中除了SC07和SC12在引物OF24299-844中未擴(kuò)增出條帶外，這12份樣本在3對引物中均表現(xiàn)出與 ‘朱砂丹桂’一致的帶型，可以判斷這些樣本為 ‘朱砂丹桂’；第Ⅳ類中，包含了剩余的4個(gè)已知品種和2種待鑒定樣本。在相對距離為6時(shí)，可將第Ⅳ類分為2組：a組，SC06先與 ‘堰虹桂’聚為一小支，再與‘武夷丹桂’聚為一支，SC06與 ‘堰虹桂’在帶型上完全一致的，可判斷彭州市來源的丹桂為 ‘堰虹桂’；b組， ‘滿條紅’和 ‘狀元紅’先聚為一小支，再與SC08聚為一支，說明SC08與 ‘滿條紅’和‘狀元紅’親緣關(guān)系較近。

圖2 部分EST-SSR引物復(fù)篩電泳結(jié)果圖Figure 2 A part of EST-SSR primers screening electrophoresis figure for the second time

3 結(jié)論與討論

建立穩(wěn)定可靠的SSR-PCR反應(yīng)體系是EST-SSR分子標(biāo)記開發(fā)和利用的基礎(chǔ)，SSR體系優(yōu)化的方法有單因素試驗(yàn)、完全試驗(yàn)或正交試驗(yàn)［14］。單因素試驗(yàn)不能保證各最佳組分的組合即為最佳的反應(yīng)體系；完全試驗(yàn)卻存在試驗(yàn)組合繁多，工作量大，試驗(yàn)周期長等弊端［15-17］；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)則是僅選用幾個(gè)具有代表性的處理組合進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果分析簡便直觀，可操作性強(qiáng)［18］。袁存權(quán)等［19］利用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對刺槐Robinia pseudoacacia的相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（SRAP-PCR）體系中的主要成分進(jìn)行的優(yōu)化，楊傳平等［20］也成功利用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化并建立了一套適用于白樺Betula platyphylla的SSR-PCR反應(yīng)體系。本研究也利用了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化并建立了適合桂花的SSR-PCR反應(yīng)體系。

表5 3對桂花EST-SSR引物序列Table 5 Three EST-SSR primer sequences of Osmanthus fragrance

表6 品種鑒定帶型信息統(tǒng)計(jì)表Table 6 Cultivars with type information statistics

圖3 歐氏平均聯(lián)接法生成的21份桂花樣本的聚類樹狀圖Figure 3 Dendrogram of cluster analysis of 21 Osmanthus fragrans cultivars produced by euclidean average connection method

不同植物的多態(tài)性SSR核苷酸重復(fù)類型具有很大的差異［21］，在蠟梅Chimonanthus praecox中，李響等［22］共從120對引物中篩選獲得17對優(yōu)良的EST-SSR引物，篩出率為14.17%，主要包括二、三和六核苷酸重復(fù)類型；徐陽等［23］以杉木Cunninghamia lanceolata為材料，從10個(gè)EST-SSR和8個(gè)基因組SSR（gSSR）中各篩出4對多態(tài)性引物，多態(tài)率分別為40.00%和50.00%，所有核苷酸重復(fù)類型均有出現(xiàn)。本研究以桂花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，從完全隨機(jī)選取的150對EST-SSR引物中篩選出19對具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物，多態(tài)性比例為12.67%。其中，五核苷酸（25.00%）、六核苷酸（19.44%）和三核苷酸（16.67%）重復(fù)類型的多態(tài)性較高，充分說明可以利用桂花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫大規(guī)模進(jìn)行桂花EST-SSR引物的開發(fā)。

SSR分子標(biāo)記已經(jīng)很好地應(yīng)用于品種鑒定和親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性、交配系統(tǒng)等研究。胡菀等［5］利用SSR分子標(biāo)記對7個(gè)野生桂花群體139個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，并通過STRUCTURE聚類分析得到不同野生居群間具有較豐富的遺傳多樣性；ZHANG等［8］開發(fā)并獲得了29對具有高度多態(tài)性的SSR引物，對野生桂花種群和桂花品種分類鑒定進(jìn)行了相關(guān)遺傳研究。野生桂花遺傳變異豐富，本研究以分布距離相對分散的野生桂花為模板篩選得到的引物，具有很強(qiáng)的研究價(jià)值，再利用篩選到的3對高度多態(tài)性的EST-SSR引物將遺傳差異較小的7個(gè)已知丹桂品種進(jìn)行有效地區(qū)分，鑒定了來自于四川成都的14份丹桂樣本。結(jié)果表明：四川常見的栽培丹桂品種大部分為 ‘朱砂丹桂’，來源于彭州市丹桂SC06為 ‘堰虹桂’，而來源于新都區(qū)的SC08與 ‘滿條紅’和 ‘狀元紅’親緣關(guān)系較近。EST-SSR來源于基因的編碼區(qū)，與功能基因緊密連鎖，并且EST的高度保守性使得EST-SSR在同物種的不同品種間乃至不同物種間具有較高的通用性，所以可以對決定重要表型性狀的等位基因進(jìn)行直接鑒定［24-25］。本研究利用桂花轉(zhuǎn)錄組開發(fā)獲得的EST-SSR引物在桂花品種鑒定中具有可靠性和適用性，可為后期桂花遺傳多樣性和親緣關(guān)系以及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等研究奠定基礎(chǔ)。

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