柳明忠　曾榮東　張志珊　鄭錦陽(yáng)

[摘要]目的為探究塞來(lái)昔布對(duì)創(chuàng)傷性異位骨化大鼠模型的BMP-4的影響。方法該研究于2016年5月-2017年4月給予該院建立的創(chuàng)傷性異位骨化模型大鼠予喂食塞來(lái)昔布，分別采取喂食2周、6周、10周的不同方案，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR及western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)模型大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)含量。結(jié)果塞來(lái)昔布處理后大鼠，實(shí)時(shí)定量PCR及western blot顯示：相比于生理鹽水處理大鼠，塞來(lái)昔布處理大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)明顯下調(diào)，并且隨著塞來(lái)昔布處理時(shí)間的延長(zhǎng)，BMP-4的表達(dá)也相應(yīng)的下調(diào)。結(jié)論塞來(lái)昔布可通過(guò)降低大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)以干預(yù)異位骨化

[關(guān)鍵詞]塞來(lái)昔布；異位骨化；BMP-4

[中圖分類號(hào)]R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1674-0742（2017）10（a）-0018-04

臨床上將骨組織以外發(fā)生的骨化稱為異位骨化（Heterotopic ossification，HO），其本質(zhì)是一種以局部纖維組織增生、鈣化、化生及伴有異位新骨形成為主要病理特征的非腫瘤反應(yīng)性病變。主要發(fā)病人群為肘關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)外傷患者，發(fā)生后會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直、僵硬等癥狀，關(guān)節(jié)活動(dòng)度明顯受限，對(duì)患者生活和工作造成影響。因此，如何防治異位骨化，已經(jīng)成為廣大相關(guān)骨科工作者的重要課題。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone nor.phogenetio protein，BMP）是誘導(dǎo)異位骨化的主要活性介質(zhì)。主要參與骨骼的生長(zhǎng)、發(fā)育及創(chuàng)傷的修復(fù)，其作用的靶細(xì)胞是未分化的、有活性的間充質(zhì)細(xì)胞，對(duì)肌肉、血管周?chē)g充質(zhì)細(xì)胞具有誘導(dǎo)作用，并能夠?qū)浌羌?xì)胞和骨細(xì)胞進(jìn)行不可逆性的分化。1965年Urist等發(fā)現(xiàn)脫鈣的骨基質(zhì)可以誘導(dǎo)異位骨化的形成，林霖等直接注射BMP-4重組腺病毒在裸鼠肌肉內(nèi)成功誘導(dǎo)出異位骨化，提示BMP-4與異位骨化的發(fā)生關(guān)系密切。結(jié)合非甾體抗炎藥在異位骨化治療中扮演的重要角色，以及前期研究發(fā)現(xiàn)BMP-4在異位骨化進(jìn)展中所起的重要作用，該研究于2016年5月-2017年4月給予該院建立的創(chuàng)傷性異位骨化模型大鼠予喂食塞來(lái)昔布來(lái)治療，分別采取喂食2、6、10周的不同方案，治療后觀察各組大鼠肢體的皮溫、腫脹程度及X線表現(xiàn)，并測(cè)定模型大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)及其含量。從而為COX-2選擇性抑制劑臨床預(yù)防HO及使用療程提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取48只健康雄性wistar大鼠，體重均位于220～240g之間。所有大鼠均購(gòu)買(mǎi)于山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2主要試劑

美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)的塞來(lái)昔布、美國(guó)santa公司生產(chǎn)的多克隆抗體、碧云天公司生產(chǎn)的蛋白酶抑制劑。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備

將48只sD級(jí)體重（100+10）g大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，每組各10只。右側(cè)為實(shí)驗(yàn)組。各組大鼠均建立創(chuàng)傷性異位骨化模型，造模方法：給予大鼠腹腔注射2%氯胺酮進(jìn)行麻醉，劑量為80～100mg/kg。麻醉成功后，將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，對(duì)手術(shù)區(qū)域皮膚進(jìn)行脫毛，并使用碘伏進(jìn)行常規(guī)消毒，無(wú)菌手術(shù)刀片沿大鼠右跟腱縱行切開(kāi)1cm皮膚切口，顯露跟腱止點(diǎn)，垂直切口方向橫行切斷近止點(diǎn)部跟腱，術(shù)后全層縫合切口。

1.4大鼠創(chuàng)傷性異位骨化模型的治療

術(shù)后第1天開(kāi)始給藥，第1、3、5組大鼠均予塞來(lái)昔布10mg/（kg·d）喂食，第1組喂食2周，第3組喂食6周，第5組喂食10周，第2、4、6組分別喂食2mL生理鹽水2周、6周或10周。各組均灌胃1次，d，術(shù)后第1周隔天觀察1次，1周后每周觀察1次。

1.5大鼠創(chuàng)傷性異位骨化模型效果評(píng)價(jià)

對(duì)比各組大鼠術(shù)后10周的皮溫、腫脹程度，于麻醉狀態(tài)下拍攝各組大鼠右肢側(cè)位X線片，觀察各組大鼠是否有新骨形成。其中鑒于未有指南明確表明，以上指標(biāo)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。②該研究擬：皮溫取所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的皮溫平均值。腫脹程度：評(píng)分范圍0～3分，O分為無(wú)腫脹，1分為腫脹位于損傷點(diǎn)，2分為腫脹位于膝關(guān)節(jié)，3分為腫脹位于膝關(guān)節(jié)以上。新骨形成情況：評(píng)分范圍0～1分，0分為無(wú)新骨形成，1分為有新骨形成。③檢測(cè)各組大鼠術(shù)后10周跟腱組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP-4）的含量。

1.6骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP-4）含量檢測(cè)

分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)和western blot檢測(cè)。（1）實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：研究標(biāo)本為大鼠跟腱組織，采集大鼠跟腱組織后，加入適量trizo，在零下20%的環(huán)境中孵育15min，以1200r/min的速度離心10min，在跟腱組織標(biāo)本液中加入75%乙醇進(jìn)行沉淀，使用DEPC水將沉淀物質(zhì)溶解，放置于零下70%的冰箱中。之后進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄提取和熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：①溫度95%、預(yù)變性、時(shí)間10min；②溫度95%、變性、時(shí)間15s；③溫度60%、退火、時(shí)間30s；④溫度72%、延伸、時(shí)間30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；⑤72℃末次延伸時(shí)間為5min。（2）western blot：收集大鼠跟腱組織，提取蛋白，測(cè)定濃度（BCA法），然后取等量蛋白上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入抗大鼠BNP-4，在4℃條件下孵育過(guò)夜，孵育1h后加入二抗山羊抗小鼠IgG，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光顯色，內(nèi)參為GAPDH。最后應(yīng)用iomad western分析儀自動(dòng)分析測(cè)定蛋白表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)分析軟件Graph Pad 6.0。不同組別間采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

塞來(lái)昔布可通過(guò)降低大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)以干預(yù)異位骨化。

進(jìn)一步為探究塞來(lái)昔布可明顯干預(yù)大鼠異位性骨化的具體機(jī)制，檢測(cè)了塞來(lái)昔布及生理鹽水處理大鼠異位骨化模型中跟腱組織中，與異位骨化顯著相關(guān)分子BMP-4的表達(dá)。在mRNA水平上，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：相比于生理鹽水處理大鼠，塞來(lái)昔布處理大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)明顯下調(diào).并且隨著塞來(lái)昔布處理時(shí)間的延長(zhǎng)，BMP-4的表達(dá)也相應(yīng)的下調(diào)。為進(jìn)一步確認(rèn)BMP-4在塞來(lái)昔布影響異位骨化中的作用，我們采用western blot實(shí)驗(yàn)，從蛋白角度出發(fā)，結(jié)果同樣顯示：比于生理鹽水處理大鼠，塞來(lái)昔布處理大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)明顯下調(diào)，并且隨著塞來(lái)昔布處理時(shí)間的延長(zhǎng)，BMP-4的表達(dá)也相應(yīng)的下調(diào)。由上述內(nèi)容可知，塞來(lái)昔布會(huì)導(dǎo)致大鼠跟腱組織中的BMP-4的表達(dá)含量減少，影響異位骨化的形成。