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        塞來昔布對創(chuàng)傷性異位骨化模型大鼠的BMP—4影響

        2018-03-22 04:14:20柳明忠曾榮東張志珊鄭錦陽
        中外醫(yī)療 2017年28期
        關(guān)鍵詞:塞來跟腱骨化

        柳明忠 曾榮東 張志珊 鄭錦陽

        [摘要]目的為探究塞來昔布對創(chuàng)傷性異位骨化大鼠模型的BMP-4的影響。方法該研究于2016年5月-2017年4月給予該院建立的創(chuàng)傷性異位骨化模型大鼠予喂食塞來昔布,分別采取喂食2周、6周、10周的不同方案,通過實時定量PCR及western blot實驗,檢測模型大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)含量。結(jié)果塞來昔布處理后大鼠,實時定量PCR及western blot顯示:相比于生理鹽水處理大鼠,塞來昔布處理大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)明顯下調(diào),并且隨著塞來昔布處理時間的延長,BMP-4的表達(dá)也相應(yīng)的下調(diào)。結(jié)論塞來昔布可通過降低大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)以干預(yù)異位骨化

        [關(guān)鍵詞]塞來昔布;異位骨化;BMP-4

        [中圖分類號]R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1674-0742(2017)10(a)-0018-04

        臨床上將骨組織以外發(fā)生的骨化稱為異位骨化(Heterotopic ossification,HO),其本質(zhì)是一種以局部纖維組織增生、鈣化、化生及伴有異位新骨形成為主要病理特征的非腫瘤反應(yīng)性病變。主要發(fā)病人群為肘關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)外傷患者,發(fā)生后會導(dǎo)致患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直、僵硬等癥狀,關(guān)節(jié)活動度明顯受限,對患者生活和工作造成影響。因此,如何防治異位骨化,已經(jīng)成為廣大相關(guān)骨科工作者的重要課題。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone nor.phogenetio protein,BMP)是誘導(dǎo)異位骨化的主要活性介質(zhì)。主要參與骨骼的生長、發(fā)育及創(chuàng)傷的修復(fù),其作用的靶細(xì)胞是未分化的、有活性的間充質(zhì)細(xì)胞,對肌肉、血管周圍間充質(zhì)細(xì)胞具有誘導(dǎo)作用,并能夠?qū)浌羌?xì)胞和骨細(xì)胞進(jìn)行不可逆性的分化。1965年Urist等發(fā)現(xiàn)脫鈣的骨基質(zhì)可以誘導(dǎo)異位骨化的形成,林霖等直接注射BMP-4重組腺病毒在裸鼠肌肉內(nèi)成功誘導(dǎo)出異位骨化,提示BMP-4與異位骨化的發(fā)生關(guān)系密切。結(jié)合非甾體抗炎藥在異位骨化治療中扮演的重要角色,以及前期研究發(fā)現(xiàn)BMP-4在異位骨化進(jìn)展中所起的重要作用,該研究于2016年5月-2017年4月給予該院建立的創(chuàng)傷性異位骨化模型大鼠予喂食塞來昔布來治療,分別采取喂食2、6、10周的不同方案,治療后觀察各組大鼠肢體的皮溫、腫脹程度及X線表現(xiàn),并測定模型大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)及其含量。從而為COX-2選擇性抑制劑臨床預(yù)防HO及使用療程提供實驗基礎(chǔ)。

        1材料與方法

        1.1實驗動物

        實驗動物:選取48只健康雄性wistar大鼠,體重均位于220~240g之間。所有大鼠均購買于山東大學(xué)動物實驗中心。

        1.2主要試劑

        美國Gibco公司生產(chǎn)的塞來昔布、美國santa公司生產(chǎn)的多克隆抗體、碧云天公司生產(chǎn)的蛋白酶抑制劑。

        1.3實驗動物模型制備

        將48只sD級體重(100+10)g大鼠,雌雄各半,隨機(jī)分為6組,每組各10只。右側(cè)為實驗組。各組大鼠均建立創(chuàng)傷性異位骨化模型,造模方法:給予大鼠腹腔注射2%氯胺酮進(jìn)行麻醉,劑量為80~100mg/kg。麻醉成功后,將大鼠固定在手術(shù)臺上,對手術(shù)區(qū)域皮膚進(jìn)行脫毛,并使用碘伏進(jìn)行常規(guī)消毒,無菌手術(shù)刀片沿大鼠右跟腱縱行切開1cm皮膚切口,顯露跟腱止點(diǎn),垂直切口方向橫行切斷近止點(diǎn)部跟腱,術(shù)后全層縫合切口。

        1.4大鼠創(chuàng)傷性異位骨化模型的治療

        術(shù)后第1天開始給藥,第1、3、5組大鼠均予塞來昔布10mg/(kg·d)喂食,第1組喂食2周,第3組喂食6周,第5組喂食10周,第2、4、6組分別喂食2mL生理鹽水2周、6周或10周。各組均灌胃1次,d,術(shù)后第1周隔天觀察1次,1周后每周觀察1次。

        1.5大鼠創(chuàng)傷性異位骨化模型效果評價

        對比各組大鼠術(shù)后10周的皮溫、腫脹程度,于麻醉狀態(tài)下拍攝各組大鼠右肢側(cè)位X線片,觀察各組大鼠是否有新骨形成。其中鑒于未有指南明確表明,以上指標(biāo)的評判標(biāo)準(zhǔn)。②該研究擬:皮溫取所有實驗動物的皮溫平均值。腫脹程度:評分范圍0~3分,O分為無腫脹,1分為腫脹位于損傷點(diǎn),2分為腫脹位于膝關(guān)節(jié),3分為腫脹位于膝關(guān)節(jié)以上。新骨形成情況:評分范圍0~1分,0分為無新骨形成,1分為有新骨形成。③檢測各組大鼠術(shù)后10周跟腱組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)的含量。

        1.6骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)含量檢測

        分別進(jìn)行實時定量PCR檢測和western blot檢測。(1)實時定量PCR檢測:研究標(biāo)本為大鼠跟腱組織,采集大鼠跟腱組織后,加入適量trizo,在零下20%的環(huán)境中孵育15min,以1200r/min的速度離心10min,在跟腱組織標(biāo)本液中加入75%乙醇進(jìn)行沉淀,使用DEPC水將沉淀物質(zhì)溶解,放置于零下70%的冰箱中。之后進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄提取和熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:①溫度95%、預(yù)變性、時間10min;②溫度95%、變性、時間15s;③溫度60%、退火、時間30s;④溫度72%、延伸、時間30s,共進(jìn)行40個循環(huán);⑤72℃末次延伸時間為5min。(2)western blot:收集大鼠跟腱組織,提取蛋白,測定濃度(BCA法),然后取等量蛋白上樣電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入抗大鼠BNP-4,在4℃條件下孵育過夜,孵育1h后加入二抗山羊抗小鼠IgG,經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光顯色,內(nèi)參為GAPDH。最后應(yīng)用iomad western分析儀自動分析測定蛋白表達(dá)量。

        1.7統(tǒng)計方法

        統(tǒng)計分析軟件Graph Pad 6.0。不同組別間采用t檢驗分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2結(jié)果

        塞來昔布可通過降低大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)以干預(yù)異位骨化。

        進(jìn)一步為探究塞來昔布可明顯干預(yù)大鼠異位性骨化的具體機(jī)制,檢測了塞來昔布及生理鹽水處理大鼠異位骨化模型中跟腱組織中,與異位骨化顯著相關(guān)分子BMP-4的表達(dá)。在mRNA水平上,通過實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn):相比于生理鹽水處理大鼠,塞來昔布處理大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)明顯下調(diào).并且隨著塞來昔布處理時間的延長,BMP-4的表達(dá)也相應(yīng)的下調(diào)。為進(jìn)一步確認(rèn)BMP-4在塞來昔布影響異位骨化中的作用,我們采用western blot實驗,從蛋白角度出發(fā),結(jié)果同樣顯示:比于生理鹽水處理大鼠,塞來昔布處理大鼠跟腱組織BMP-4的表達(dá)明顯下調(diào),并且隨著塞來昔布處理時間的延長,BMP-4的表達(dá)也相應(yīng)的下調(diào)。由上述內(nèi)容可知,塞來昔布會導(dǎo)致大鼠跟腱組織中的BMP-4的表達(dá)含量減少,影響異位骨化的形成。

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