石小燕，劉 嶸

(1. 湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)分院,湖北 孝感 432000；2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的健康，其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中占第3位，但是卵巢癌患者病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首[1]。目前卵巢癌主要治療方法是化療，常用的化療藥物有順鉑、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿和放線菌素D等。然而化療藥物具有較大的毒副作用且較易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療的臨床療效并不是很理想。因此，尋找新的能夠殺傷卵巢癌細(xì)胞的化合物和天然產(chǎn)物具有十分重要的意義。藥用植物用來治療腫瘤已有幾千年的歷史，據(jù)統(tǒng)計(jì)世界上已有3 000多種植物用于腫瘤的治療[2]。木香烴內(nèi)酯是一類來源于多種草藥的倍半萜內(nèi)酯類化合物，其具有消炎、抗氧化、抗血管新生以及抗腫瘤等特性，但對卵巢癌細(xì)胞系的作用及對卵巢癌中NF-κB信號(hào)通路的影響并不清楚。本研究以卵巢癌細(xì)胞系Skov3為研究對象，觀察了木香烴內(nèi)酯對Skov3細(xì)胞增殖、凋亡及NF-κB信號(hào)通路的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1藥物、試劑與儀器 木香烴內(nèi)酯由南開大學(xué)提供，純度>98%，用DMSO配制成20 mmol/L儲(chǔ)備液，分裝保存入-20 ℃?zhèn)溆?。RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清購自Gibco公司，MTT和DMSO購自sigma公司。流式細(xì)胞儀為美國BD公司，Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司。NF-κB p65、Caspase-3、Caspase-9和β-actin蛋白抗體購自CST公司，化學(xué)發(fā)光顯色試劑購自Thermo公司。

1.2細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞系Skov3由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1木香烴內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞系Skov3生長影響實(shí)驗(yàn) 采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的Skov3細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104mL-1，將細(xì)胞鋪入96孔板中，每孔200 μL，使每孔最終細(xì)胞數(shù)為1×104/孔。將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中12 h使細(xì)胞貼壁。取保存于-20 ℃的木香烴內(nèi)酯化合物，按照濃度梯度稀釋，按照一定的體積加入終濃度為0.25，0.5，1，2.5，5，10, 20 μmol/L的木香烴內(nèi)酯。木香烴內(nèi)酯作用72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h。孵育結(jié)束后，2 000 r/min離心15 min，棄上清。沉淀用200 μL DMSO重懸，充分溶解后檢測OD 570 nm吸光值。

1.3.2木香烴內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞系Skov3凋亡影響實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的Skov3細(xì)胞，用胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度5×104mL-1，將細(xì)胞鋪入6孔板中，每孔最終細(xì)胞數(shù)為5×104，體積為1 mL。將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12 h使細(xì)胞完全貼壁。按照一定體積加入木香烴內(nèi)酯使總濃度分別為0.5，1，2.5，5 μmol/L。同時(shí)設(shè)置對照孔，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，將細(xì)胞收集于流式管中，1 200 r/min離心7 min后棄上清。沉淀用100 μL 1×binding buffer重懸，每管分別標(biāo)記5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后，每管補(bǔ)加200 μL 1×binding buffer，于1 h內(nèi)流式檢測細(xì)胞凋亡率，注意設(shè)置單陽管。根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞所表現(xiàn)出來的特征把細(xì)胞分為3類，Annexin V+/PI+為中晚期凋亡細(xì)胞，Annexin V+/PI-為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-/PI-為活細(xì)胞，早期細(xì)胞凋亡率和中晚期細(xì)胞凋亡率合計(jì)為細(xì)胞凋亡率。

1.3.3木香烴內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞系Skov3中NF-κB p65基因表達(dá)影響實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的Skov3細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104mL-1，按照1 mL/孔接種于6孔板中。37 ℃孵箱中培養(yǎng)12 h使細(xì)胞完全貼壁后加入終濃度為1，2.5，5 μmol/L的木香烴內(nèi)酯處理，24 h后收集細(xì)胞。將細(xì)胞用Trizol裂解，Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)部RNA，采用RT-PCR法檢測NF-κB p65基因表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參照，以DMSO為對照，計(jì)算ΔΔCt值。

1.3.4木香烴內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞系Skov3中NF-κB及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響實(shí)驗(yàn) 采用Western Blot法檢測。取對數(shù)生長期的Skov3細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104mL-1，按照1 mL/孔接種于6孔板中。37 ℃孵箱中培養(yǎng)12 h使細(xì)胞完全貼壁后加入終濃度為1，2.5，5 μmol/L的木香烴內(nèi)酯處理，24 h后收集細(xì)胞。將細(xì)胞用200 μL RIPA重懸，冰上裂解30 min(每10 min震蕩混勻1次)，然后12 000 r/min 4 ℃離心15 min，吸取蛋白上清。在蛋白上清中加入5×載樣緩沖液，100 ℃煮樣5 min使蛋白充分變性。配制12%的蛋白膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上層濃縮膠電壓為60 V，下層分離膠為110 V。電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶室溫封閉1 h后，孵育NF-κB p65、Caspase-3和Caspase-9一抗過夜，洗去未結(jié)合的一抗后孵育一定比例稀釋的二抗，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行處理分析，組間比較采用配對t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1木香烴內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞系Skov3生長影響0 μmol/L木香烴內(nèi)酯對細(xì)胞生長抑制率為(0.30±1.60)%，0.25 μmol/L為(2.28±1.13)%，0.5 μmol/L為(10.37±1.48)%，1 μmol/L為(30.04±1.40)%，2.5 μmol/L為(35.04±2.37)%，5 μmol/L為(46.34±3.06)%，10 μmol/L為(67.03±2.42)%,20 μmol/L為(73.25±4.26)%，50 μmol/L為(84.47±2.54)%。在0～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)木香烴內(nèi)酯對Skov3細(xì)胞的生長抑制作用具有明顯的濃度依賴性，木香烴內(nèi)酯對Skov3細(xì)胞的IC50為5.11 μmol/L。

2.2木香烴內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞系Skov3凋亡影響經(jīng)過不同濃度木香烴內(nèi)酯處理Skov3細(xì)胞24 h后，細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯凋亡。隨著木香烴內(nèi)酯濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比例明顯增加，其中木香烴內(nèi)酯0 μmol/L時(shí)細(xì)胞凋亡率為(7.40±2.90)%，2.5 μmol/L時(shí)為(11.84±0.95)%，5 μmol/L時(shí)為(21.89±1.93)%，10 μmol/L時(shí)為(57.6±3.39)%，20 μmol/L時(shí)為(84.1±0.78)%，各濃度間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1及表1。

2.3木香烴內(nèi)酯對人卵巢癌細(xì)胞系Skov3中NF-κB基因表達(dá)影響 不同濃度木香烴內(nèi)酯處理24 h后，NF-κB基因表達(dá)量濃度依賴性的下調(diào)，各濃度間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖2。

圖1 不同濃度木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系Skov3凋亡代表性散點(diǎn)圖

表1 不同濃度木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞系Skov3凋亡情況

圖2 不同濃度木香烴內(nèi)酯組NF-κB p65基因表達(dá)情況

2.4木香烴內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞系Skov3中NF-κB蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白影響 不同濃度木香烴內(nèi)酯處理24 h后，5 μmol/L和10 μmol/L木香烴內(nèi)酯組細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65和Caspase-3蛋白濃度均明顯低于2.5μmol/L木香烴內(nèi)酯組(P均<0.05)，5μmol/L和10 μmol/L 木香烴內(nèi)酯組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；10 μmol/L木香烴內(nèi)酯組Caspase-9蛋白濃度明顯低于2.5 μmol/L和5 μmol/L木香烴內(nèi)酯組(P均<0.05)，2.5 μmol/L和5 μmol/L木香烴內(nèi)酯組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3及表2。

3 討 論

圖3 不同濃度木香烴內(nèi)酯組卵巢癌細(xì)胞系Skov3中NF-κB蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表2 不同濃度木香烴內(nèi)酯組卵巢癌細(xì)胞系Skov3中NF-κB蛋白及凋亡相關(guān)蛋白水平比較

注：①與2.5 μmol/L木香烴內(nèi)酯組比較，P<0.05。

木香烴內(nèi)酯主要來源于風(fēng)毛菊屬和月桂屬植物的根部，對白血病、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及膀胱癌等多種類型的腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷作用[3]，其在抗腫瘤中的主要作用有誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)通路、端粒酶活性抑制、抑制腫瘤侵襲和遷移等[4-7]。本研究結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯對人卵巢癌細(xì)胞系生長有明顯抑制作用，且隨著木香烴內(nèi)酯濃度的提高，細(xì)胞凋亡率明顯升高，說明木香烴內(nèi)酯主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用的。而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制有很多，Yang等[8]發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)部ROS的積累從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Butturini等[9]在急性髓系白血病中的研究發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯能夠抑制STAT3的磷酸化以及其與DNA的結(jié)合。

NF-κB是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控。NF-κB蛋白家族包括p50/p105、p52/p100、RelA/p65和C-Rel，其中RelA/p65 是NF-κB家族常見的重要轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及惡化過程中起重要作用，且參與多種腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此NF-κB可以作為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[10]。目前報(bào)道的靶向NF-κB從而發(fā)揮抗腫瘤作用的化合物主要包括小白菊內(nèi)酯、含笑內(nèi)酯以及Da0324等[11-13]。Lin等[14]研究表明抑制NF-κB能夠激活Caspase家族蛋白從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯能夠抑制卵巢癌細(xì)胞中的NF-κB基因和蛋白的表達(dá)并呈明顯的濃度依賴性，促進(jìn)Caspase-3和Caspase-9的剪切，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，木香烴內(nèi)酯可通過抑制NF-κB基因及蛋白表達(dá)，激活Caspase-3和Caspase-9而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，為卵巢癌的治療提供了新的選擇和思路。

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