宋 燕，吳瓊蔚

(上海市長寧區(qū)婦幼保健院，上海 200051)

全世界范圍內(nèi)，宮頸癌已成為女性發(fā)病率僅次于乳腺癌的第二大常見惡性腫瘤和女性癌癥死亡的第三大原因[1-3]。人乳頭狀瘤病毒(HPV)的預(yù)防性疫苗對宮頸癌的預(yù)防有重要意義，但晚期復(fù)發(fā)的子宮頸癌治療效果差，病死率高，且宮頸癌的發(fā)病機制目前仍不清楚。 因此，研究宮頸癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找有效的診斷和鑒定的分子治療靶點，可能有助于子宮頸癌患者的治療。長非編碼RNAs(long noncoding RNA，lncRNAs，大于200個核苷酸的長度)主要通過表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，從而參與機體的生物學(xué)功能，是具有蛋白編碼能力的lncRNA家族的新成員[4-6]。新的證據(jù)表明，lncRNAs具有重要的生物學(xué)功能，與人類癌癥密切相關(guān)[7-8]。SPRY4內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1(SPRY4 intronic transcript 1，SPRY4-IT1)屬于lncRNA的一種，來自SPRY4基因內(nèi)含子的一個過程，其在多種腫瘤中表達上調(diào)，可促進腫瘤細胞的增殖分化侵襲，同時抑制細胞凋亡[9-10]。在宮頸癌的致病基因中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種與其密切相關(guān)的lncRNAs，如HOTAIR、H19、GAS5、MEG3等[11-14]，為目前宮頸癌發(fā)病機制的研究以及早期診斷和治療提供了重要的分子靶點和理論依據(jù)。新近研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SPRY4-IT1在骨肉瘤、胃腸道等多種腫瘤中表達異常，SPRY4-IT1是骨肉瘤的致病基因之一[7]。但lncRNA SPRY4-IT1在宮頸癌中的表達及作用報道較少，因此，本研究著重探討了lncRNA SPRY4-IT1在宮頸癌細胞中的表達及其對細胞生物學(xué)行為的影響。

1 實驗資料

1.1細胞株及培養(yǎng) 人宮頸癌細胞株HeLa 和正常人宮頸永生化上皮細胞系H8(NC細胞)購自中國科學(xué)院中國細胞庫(上海)。所有的細胞用10%熱滅活胎牛血清、100 IU/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素DMEM培養(yǎng)液，放置在37 ℃含5% CO2的潮濕空氣中培養(yǎng)。

1.2RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)按Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNAs，按照說明書用引物和上標Ⅱ寡聚脫氧胸腺嘧啶逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(Invitrogen)。在20 μL含有SYBR Green反應(yīng)混合物作用下反應(yīng)組合共擴增出3個復(fù)制的樣本(Qiagen公司，德國)和0.5 mm的引物，并用羅氏(Roche) LightCycle分析(巴塞爾，瑞士)。引物的序列：SPRY4-IT1上游為5’- AGCCACATAAATTCAGCAGA-3’，下游為5’-CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA-3’;GAPDH上游為5’-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3’，下游為5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3’。用ABI7500進行所有qRT-PCR數(shù)據(jù)的收集。

1.3siRNA和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染 HeLa細胞及NC細胞分別接種于6孔板, 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。適量細胞接種在25 mm2培養(yǎng)皿中，至80%融合后,按照Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，CA)及?FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑(羅氏，德國)說明書操作，孵育48 h后獲得轉(zhuǎn)染細胞，通過qRT-PCR檢測其表達和清除效率。兩種si-SPRY4-IT1目標序列(Invitrogen公司建造提供)包括si-SPRY4-IT1-1(CCCAGAATGTTGACAGCTGCCTCTT)和si-SPRY4-IT1-2(GCTTTCTGATTCCAAGGCCTATTAA)，后者具有最高的抑制功效。為了實現(xiàn)SPRY4-IT1異位表達，合成SPRY4-IT1序列(708 bp)亞克隆到pEGFP-N1質(zhì)粒載體。在SPRY4-IT1序列插入載體中后，進行測序分析以確保這個載體可以特異表達SPRY4-IT1。收集處于對數(shù)生長期的HeLa細胞及NC細胞，提取細胞總RNA，采用qRT-PCR法檢測SPRY4-IT1表達情況。si-SPRY4-IT1轉(zhuǎn)染HeLa細胞48 h后，抽提細胞總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR法檢測SPRY4-IT1 mRNA表達情況。

1.4細胞增殖檢測 MTT法測定細胞增殖情況。將濃度為1×104L-1細胞液接種孵育于96孔培養(yǎng)板上。根據(jù)制造商的指導(dǎo)用脂質(zhì)體2000將si-SPRY4-IT1和si-NC轉(zhuǎn)染成細胞，然后孵育在37 ℃，加入質(zhì)量分數(shù)為5 mg/mL的MTT(20 μL/孔)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 h后取出，棄上清，加入DMSO(Sigma Aldrich)150 μL/孔，震蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解。分別于溶解后的24 h、48 h、72 h在570 nm處測定各孔吸光度OD值。所有的實驗都進行3次?？寺⌒纬稍囼灒菏占D(zhuǎn)染細胞接種于密度為1 000個細胞/孔的六孔培養(yǎng)板中，在37 ℃和5% CO2條件的孵化器內(nèi)培養(yǎng)2周。然后用10%甲醛固定30 min后，用1%結(jié)晶紫對菌落進行染色，每次5 min，用光學(xué)顯微鏡計數(shù)和計算各組的菌落數(shù)。結(jié)果取平均值。

1.5細胞凋亡及凋亡周期的檢測 轉(zhuǎn)染的細胞用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌并用胰酶消化細胞制成懸液，固定在冰冷的乙醇中。加入濃度為2 mg/mL牛胰RNase(Sigma Aldrich)在37 ℃下培養(yǎng)30 min后，細胞再用20 mg/mL碘化丙啶染色(PI，Sigma Aldrich)，在室溫下培養(yǎng)20 min后檢測細胞凋亡情況。根據(jù)細胞凋亡檢測試劑盒標記的Annexin vfitc(Invitrogen)進行操作，用流式細胞儀(BD Biosciences,Mansfield,MA,USA)定量分析細胞周期分布和細胞凋亡率。

1.6細胞體外遷移和侵襲實驗 細胞轉(zhuǎn)染成功后，應(yīng)用Transwell侵襲實驗試劑盒檢測其侵襲力變化(8ìm pore;BD Biosciences,San Jose,CA USA)。入侵檢測：用100 μL無血清培養(yǎng)基重懸細胞加入Matrigel上室，將500 μL 10% FBS培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h后，未侵入細胞表面用棉簽擦拭除去，侵入到下室的細胞甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，干燥，并拍照。遷移實驗：將預(yù)先準備的100 μL無血清培養(yǎng)的細胞置于無基底膜頂部室，將500 μL 10% FBS培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)16 h后，表面細胞和骨細胞遷移到下室并固定，如上面所描述的染色。選取5個有代表性的領(lǐng)域，在顯微鏡下計數(shù)入侵或遷移的細胞數(shù)量，計算平均值。

2 結(jié) 果

2.1SPRY4-IT1在宮頸癌HeLa細胞和NC細胞中表達情況 SPRY4-IT1在HeLa細胞中表達量為3.08±0.12，在NC細胞中表達量為1.08±0.09，二者表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2si-SPRY4-IT1組和si-NC組SPRY4-IT1 mRNA表達情況 si-SPRY4-IT1-1組的SPRY4-IT1 mRNA表達量為0.35±0.04,si-SPRY4-IT1-2組的SPRY4-IT1 mRNA表達量為0.19±0.03，si-NC組的SPRY4-IT1 mRNA表達量為0.98±0.03，si-SPRY4-IT1-1組和si-SPRY4-IT1-2組SPRY4-IT1 mRNA表達量均明顯低于NC組(P均<0.05) 。

2.3SPRY4-IT1組和NC組細胞增殖情況 在24 h、48 h、72 h 3個時間點，SPRY4-IT1-1組和SPRY4-IT1-2組與NC組相比，細胞出現(xiàn)明顯增殖效應(yīng)。見圖1。

圖1 SPRY4-IT1組和NC組細胞增殖情況

2.4si-SPRY4-IT1組和si-NC組細胞增殖情況在24 h、48 h、72 h 3個時間點，si-SPRY4-IT1-1組和si-SPRY4-IT1-2組與si-NC組相比,細胞的增殖力明顯下降。見圖2。

圖2 si-SPRY4-IT1 轉(zhuǎn)染HeLa細胞凋亡情況

2.5si-SPRY4-IT1組和si-NC組細胞周期及凋亡率比較 si-SPRY4-IT1-1組和si-SPRY4-IT1-2組G0/G1期細胞所占比例明顯高于si-NC組(P均<0．05)，S期和G2/M期細胞所占比例明顯低于si-NC組(P均<0．05)，見表1及圖3。si-NC組細胞凋亡率為(4.98±1.27)%，si-SPRY4-IT1-1組為(13.37±2.54)%，si-SPRY4-IT1-2組為(15.21±3.14)%，si-SPRY4-IT1-1組和si-SPRY4-IT1-2組細胞凋亡率明顯高于si-NC組(P均<0.05)。見圖4。

表1 si-SPRY4-IT1組和si-NC組細胞周期比較%)

圖3 si-SPRY4-IT1組和si-NC組細胞周期分布情況

圖4 si-SPRY4-IT1組和si-NC組細胞凋亡情況

2.6si-SPRY4-IT1組和si-NC組細胞遷移和侵襲情況 si-SPRY4-IT1-1組和si-SPRY4-IT1-2組細胞遷移和侵襲數(shù)量均明顯少于si-NC組(P均<0．05)。見表2。

表2 si-SPRY4-IT1組和si-NC組細胞遷移和侵襲情況個)

注：①與si-NC組比較，P<0.05。

3 討 論

宮頸癌是女性最常見的一種惡性腫瘤,多發(fā)生于中老年女性。該病的發(fā)病機制不明，現(xiàn)有的治療方法效果差。宮頸癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是宮頸腫瘤患者的主要死亡原因。因此，研究腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移機制，尋求新的治療靶點及策略，可為降低宮頸腫瘤患者病死率提供新的思路。

近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，特定的lncRNAs已被證明是腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要因素[15]。眾多的研究團隊篩選并發(fā)現(xiàn)了可以用于宮頸癌早期臨床診斷的microRNA 分子，但是lncRNAs 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究還是比較少見的，許多基因問題還有待于進一步解決。

lncRNA SPRY4-IT1是微小lncRNA,首先報道其與分子病因?qū)W有關(guān)的是人類黑色素瘤[16]，近年研究發(fā)現(xiàn)其參與各種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17-18]。本研究證實SPRY4-IT1可促進HeLa細胞的異常增殖。Peng等[19]研究報道,抑制SPRY4-IT1可以明顯降低食管鱗狀細胞體外增殖和體內(nèi)的致瘤性。本研究結(jié)果表明,si-SPRY4-IT1 可以抑制SPRY4-IT1表達,顯著抑制HeLa細胞增殖, 并且可以明顯抑制HeLa細胞的遷移及侵襲能力，表明通過抑制SPRY4-IT1可以抑制宮頸癌細胞增殖促進其凋亡。

綜上所述,SPRY4-IT1是宮頸癌的重要致癌基因之一，其表達水平與宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)。SPRY4-IT1是宮頸癌一個潛在的治療目標和預(yù)后的生物標志物，且可能應(yīng)用于宮頸腫瘤的發(fā)病監(jiān)測，為今后研究宮頸癌侵襲及進展提供了新的分子靶點。

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