王敏哲，賀 欣，楊鐵虹

(空軍軍醫(yī)大學藥學系藥物分析學教研室，西安 710032)

當歸為傘形科植物Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，具有補血活血、調經止痛及潤腸通便等功效[1]。當歸多糖(Angelicasinensispolysaccharide，AP)是從中藥當歸中提取的主要成分，現代醫(yī)學證實，AP具有促進造血、抗血栓和抗輻射等多種藥理活性[2-3]，特別是在抗腫瘤[4-5]和免疫調節(jié)[6-8]方面具有獨特療效。

目前，納米遞藥系統(tǒng)(Nano drug delivery systems,NDDS)已成為研究腫瘤治療的熱點方向[9-10]。其中腫瘤微環(huán)境響應型納米遞藥系統(tǒng)，可利用腫瘤微環(huán)境中獨特的性質，如較低的酸度[11]、較強的還原性[12]和各種酶的特異性高表達[13]等，實現化療藥物的智能靶向釋放[14]。近年研究表明，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在人類多種腫瘤組織中都有特異性高表達[15]，是構建腫瘤微環(huán)境酶響應型靶向納米遞藥體系的潛在靶點。

另外，天然多糖具有安全無毒、水溶性好、生物相容性好等諸多優(yōu)點，已成為理想的藥物載體[16-18]。其中AP作為納米藥物載體也具有良好的發(fā)展前景。例如陳曉颙等[19]通過當歸多糖包覆在Fe3O4表面構建磁性納米粒子，并負載5-Fu，結果表明,AP是一種良好的納米藥物載體。徐希明等[20]將AP進行陽離子化后通過靜電吸附帶負電荷的DNA質粒，同樣證實AP是一種理想的藥物載體。因此，本研究以AP為藥物載體，負載抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)，制備腫瘤微環(huán)境酶敏型納米遞藥體系，即AP-PP-DOX，見圖1，并初步研究其理化性質和體外抗腫瘤效果。

圖1AP-PP-DOX納米粒作用示意圖

Fig.1 The schematic diagram of the AP-PP-DOX nanoparticles

1 儀器與試藥

1.1儀器 DF-Ⅱ型集熱式磁力攪拌器(江蘇金壇億能實驗儀器廠)；FT-IR 8400紅外光譜儀(日本島津公司)；BECKMAN DU640紫外分光光度計(北京譜飛科技有限公司)；真空干燥箱(大連第四儀表廠)；JEM-2000EX型透射電鏡(日本Hitachi公司)；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀(英國Malven儀器有限公司)；Avance DMX500核磁共振儀(Bruker公司)；ZYJ-L超凈工作臺(張家口市空氣凈化工程公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Heareus公司)。

1.2試藥 當歸多糖(AP，MW 50-100KD，自制)；基質金屬蛋白酶敏感肽(PP，序列NH2-GPLGIAGQC-SH，MW814)，人重組MMP-2酶(MW72KD)，均購自上海昕浩生物科技有限公司；膠原酶潛酶活化劑(APMA)，購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；DOX·HCl、SMP、EDC和NHS,均購自Sigma公司；馬來酸酐(MA)，購自上海行知化工廠；三乙胺(TEA)，購自天津市博迪化工有限公司；二甲基亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)，購自西安化學試劑廠；細胞培養(yǎng)基DMEM、胰蛋白酶和胎牛血清，均購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

2 方法

2.1馬來?；敋w多糖(AP-MA)的合成 參考文獻[21]方法，稱取一定量AP，溶解在適量LiCl/DMF(質量分數為10 %)溶液中，加熱至完全溶解；降溫至60 ℃，依次加入催化劑TEA和MA，氮氣保護反應24 h。反應結束后，用異丙醇重結晶，得到白色沉淀，將沉淀溶解在一定量水中透析(相對分子質量8 000～14 000)，凍干得到白色絨毛狀產物即為AP-MA。

2.2當歸多糖-基質金屬蛋白酶敏感肽(AP-PP)的合成 參考文獻[22]方法，首先稱取一定量的AP-MA，溶于pH值為8.0的碳酸鹽緩沖溶液中，加入EDC和NHS，室溫反應2 h活化羧基；然后將一定量PP(AP-MA和PP摩爾比為1∶1.2)溶解后滴入上述溶液中，在4 ℃冰浴及氮氣保護條件下反應8 h，反應結束后將上述反應液移入透析袋(相對分子質量8 000-14 000)中，在去離子水中透析24 h，除去未反應的PP及雜質，最后將上述溶液凍干，即得。

2.3當歸多糖-基質金屬蛋白酶敏感肽-阿霉素(AP-PP-DOX)的合成 參考文獻[23]方法，首先將一定量的DOX·HCl和SMP(摩爾比1∶1.2)溶于適量DMF中，加入TEA(DOX·HCl和TEA摩爾比為1∶3)，在避光、室溫條件下反應2 h。反應結束后，加入冰乙醚得紅色沉淀，反復洗滌沉淀3次，再以12 000 r·min-1離心30 min，最后將沉淀真空干燥即得DOX-SMP。將一定量的凍干品AP-PP和DOX-SMP(摩爾比1∶1.2)溶于適量DMF中，加入TEA(DOX·HCl和TEA摩爾比為1∶3)，在避光、室溫條件下反應8～12 h。反應結束后將上述反應液移入透析袋(相對分子質量8 000-14 000)中，在去離子水中透析48 h，去除未反應物質及雜質,最后將上述反應液凍干，即得。

2.4結構表征 分別采用FT-IR和1H-NMR對各步反應產物進行表征。

2.5AP-PP-DOX納米粒的制備 稱取10 mg AP-PP-DOX凍干品，溶于2 mL DMSO中，在去離子水中透析(相對分子質量8 000-14 000)48 h，透析結束后，超聲震蕩2 min，在10 mL量瓶中定容，用0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.6納米粒粒徑和電位的測定 稱取一定量的AP-PP-DOX納米粒，溶于一定量PBS溶液中，超聲震蕩2 min，利用粒度分析儀(DLS)進行粒徑和電位測定。

2.7TEM觀察納米粒形態(tài) 將樣品稀釋數倍后超聲分散，0.45 μm濾膜過濾，滴于銅網上，室溫干燥過夜，TEM觀察納米粒形態(tài)。

2.8載藥量的測定 稱取10 mg AP-PP-DOX納米粒溶解于10 mL pH值為7.4的PBS溶液中，質量濃度為1 mg·mL-1。取上述溶液1 mL，加入0.1 mmol·L-1稀鹽酸1 mL破壞納米粒，以12 000 r·min-1離心30 min。取離心后上清液用紫外分光光度計在480 nm處測定DOX吸光度值；利用DOX標準曲線計算DOX含量。利用公式計算載藥量：

2.9體外模擬釋藥 配制一定質量濃度的AP-PP-DOX納米粒溶液，并加入一定量MMP-2酶(預先用APMA活化)，使納米粒溶液終質量濃度為1 mg·mL-1，酶終濃度為10 nmol·L-1。將上述溶液等分為8份，于37 ℃震蕩孵育，并分別在1,2,4,6,8,10,16和24 h 8個時間點取出1份加入稀醋酸終止酶解反應，通過透析后取透析外液利用紫外分光光度計測定DOX的含量，并繪制DOX釋藥曲線；同法配制酶終濃度為20和40 nmol·L-1以及不加酶納米粒，并繪制釋藥曲線。

2.10細胞毒性實驗 將指數生長期的A549細胞配制成5×104個·mL-1的細胞懸液，按照每孔100 μL接種到96孔板上，在37 ℃、CO2含量為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄掉舊液，將含有不同質量濃度(0.03,0.1,0.3,1,3和9 μg·mL-1)的DOX、AP-PP-DOX或AP-PP-DOX+MMP-2(20 nmol·L-1)培養(yǎng)基，按照每孔100 μL加入96孔板，每種濃度設6個復孔，并設空白和對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，避光條件下每孔加入20 μL質量濃度為5 mg·mL-1的MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h形成藍色甲瓚結晶，取出細胞，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，在平板搖床上震蕩10 min，溶解藍色結晶，后用酶標儀490 nm檢測吸光度值A，依據下列公式計算細胞存活率：

3 結果

3.1結構表征 見圖2～6。由圖2可知，AP在3 386 cm-1處強吸收峰為糖分子中的O-H鍵的伸縮振動吸收，2 908 cm-1處的峰是糖分子中C-H彎曲振動吸收，這些均是糖類特征吸收峰；1 608 cm-1處是糖分子中C=O鍵的伸縮振動峰。AP-MA在3 386 cm-1處仍保留有多糖特征吸收峰，在1 735 cm-1處為AP和MA形成的酯鍵C=O的伸縮振動峰，結果表明，AP和MA成功反應生成AP-MA。

圖2AP和AP-MA紅外圖譜

Fig.2 FT-IR spectra of AP and AP-MA

圖3AP和AP-MA核磁氫譜圖

Fig.31H-NMR spectra of AP and AP-MA

由圖3可知，AP-MA在a處(6.2～6.5 ppm)形成的新峰對應多糖上引入MA后形成的雙鍵(-HC=CH-)的質子峰；b處(3.5～4.0 ppm)保留有多糖上特征氫峰，與圖2相對應，結果表明，AP-MA成功合成。

由圖4可知，AP-PP上a處(4.25～4.50 ppm)是多肽PP形成的肽鍵-NCHCO-的特征性質子峰；b處(0.80～1.20 ppm)出現了多肽PP上-CH3質子峰；c處(3.5～4.0 ppm)是多糖上的特征性質子峰。結果表明，AP-PP的成功合成。

圖4AP-MA和AP-PP核磁氫譜圖

Fig.41H-NMR spectra of AP-MA and AP-PP

圖5DOX、SMP和DOX-SMP紅外圖譜

Fig.5 FT-IR spectra of DOX，SMP and DOX-SMP

由圖5可知，SMP紅外中3 500 cm-1處是含胺類物質特征吸收峰；DOX紅外中3 313和3 525 cm-1均是-OH特征吸收峰，1 600 cm-1附近出現-C=O-特征吸收峰；DOX-SMP紅外中在3 394和1 639 cm-1處出現了新的峰，分別是酰胺鍵的-NH-特征性伸縮振動吸收峰和酰胺Ι譜帶C=O特征性伸縮振動吸收峰，證明了DOX-SMP的成功合成。

由圖6可知，a處(7.78 ppm)是DOX蒽環(huán)質子峰，b處(1.75 ppm)是DOX中-CH2-質子峰；c處(3.64 ppm)的峰對應于AP上的特征性羥基質子峰；d處(0.91 ppm)對應于多肽PP上-CH3質子峰，e處(4.26 ppm)是多肽PP形成的肽鍵中-NCHCO-特征性質子峰。結果表明，AP-PP-DOX成功合成。

圖6AP-PP-DOX核磁氫譜圖

Fig.61H-NMR spectra of AP-PP-DOX

3.2粒徑、電位和TEM圖 見圖7～8。

由圖7可知，測定納米粒平均粒徑為139.00±3.32 nm(P.I.值為0.219)，平均電位為-28.45±0.22 mV。

由圖8可知，TEM觀察到納米粒呈圓形、結構規(guī)整、分布均一，粒徑100 nm。

圖7AP-PP-DOX納米粒粒徑和電位

Fig.7 Particle size and potential of AP-PP-DOX nanoparticles

圖8AP-PP-DOX納米粒TEM圖

Fig.8 TEM image of AP-PP-DOX nanoparticles

3.3載藥量的測定 按照載藥量公式計算納米粒平均載藥量為17.00%±1.72%。

3.4MMP-2酶解釋藥實驗 將納米粒和不同質量濃度的MMP-2酶作用24 h后，測定該納米粒藥物釋放情況，結果見圖9。

圖9AP-PP-DOX納米粒體外累積釋藥曲線

A.+MMP-2(40 nmol·L-1)；b.+MMP-2(20 nmol·L-1)；c.+MMP-2(10 nmol·L-1)；d.+PBS(20 nmol·L-1)。

Fig.9Invitrocumulative drug release profile of AP-PP-DOX nanoparticles

A.+MMP-2(40 nmol·L-1)；b.+MMP-2(20 nmol·L-1)；c.+MMP-2(10 nmol·L-1)；d.+PBS(20 nmol·L-1).

圖10AP-PP-DOX對A549細胞的細胞毒性

Fig.10 Cytotoxicity of AP-PP-DOX in A549 cells

由圖9可知，釋藥實驗結果顯示，對照組納米粒(AP-PP-DOX+PBS)24 h釋藥率僅為8.69%，而實驗組納米粒[AP-PP-DOX+MMP-2(40 nmol·L-1)]24 h釋藥率高達74.5%，可見在MMP-2作用下納米粒釋藥率明顯增加；且整個釋藥曲線呈現先快后慢的趨勢，尤其是前4 h釋藥率高達60%左右，說明納米粒在MMP-2作用下能在較短時間內實現快速釋藥。另外，AP-PP-DOX+MMP-2(40 nmol·L-1)納米粒相比于AP-PP-DOX+MMP-2(20 nmol·L-1)納米粒，24 h釋藥率僅增加3%左右，說明MMP-2酶在20 nmol·L-1時已達到“飽和濃度”，再增加酶濃度并不能顯著增加釋藥率。

3.5細胞毒性實驗 不同質量濃度的納米粒和A549細胞作用48 h后其細胞毒性測定，結果見圖10。

由圖10可知，當藥物質量濃度分別為0.3和1 μg·mL-1時，AP-PP-DOX組細胞存活率顯著高于游離DOX組(P<0.05)；而當藥物質量濃度分別達3和9 μg·mL-1時，AP-PP-DOX組細胞存活率極顯著高于游離DOX組(P<0.01)，說明在相同藥物質量濃度下該納米粒細胞毒性比游離DOX低。當藥物質量濃度分別為1和3 μg·mL-1時，AP-PP-DOX+MMP-2組細胞存活率顯著高于AP-PP-DOX組(P<0.05)；而當藥物質量濃度達9 μg·mL-1時，AP-PP-DOX+MMP-2組細胞存活率極顯著高于AP-PP-DOX組(P<0.01)，說明在MMP-2作用下該納米粒對腫瘤細胞抑制率明顯增加。

4 討論

腫瘤微環(huán)境刺激響應型納米遞藥體系，能夠根據腫瘤微環(huán)境中獨特的性質，實現藥物的智能性靶向釋放，成為近年來研究靶向藥物遞送系統(tǒng)的熱點方向[24]。其中酶敏型腫瘤靶向納米遞藥體系是指將抗腫瘤藥物和載體通過酶敏肽相連，在腫瘤微環(huán)境中高表達的各種酶類，如基質金屬蛋白酶、組織蛋白酶和谷胱甘肽酶等作用下特異性裂解多肽鏈并靶向釋藥的體系[25]。

本文通過化學合成的手段將AP用MA經多步驟反應合成了AP-PP-DOX聚合物，并由此構建了基于AP的酶敏腫瘤靶向納米遞藥體系。該體系相比于其他多糖利用物理包封方法或用人工材料PEG等構建的納米遞藥體系，具有制備簡單、載藥率高的優(yōu)點。例如劉占軍等[26]利用殼寡糖包載羥基喜樹堿(HCPT)制備納米粒的載藥率僅為3.62%±0.05%；Yu H等[27]利用PEG包載羥基喜樹堿(CPT)和Dai Z等[28]利用PEG包載紫杉醇(PTX)的載藥率分別僅有3.46%和4.6%。這是因為作為大分子物質的AP，不僅水溶性良好，且擁有大量活性基團，可以化學鍵合大量的疏水性藥物DOX，形成兩親性聚合物，能很容易的通過透析法自主裝形成結構穩(wěn)定的納米粒。測定該納米粒粒徑為100 nm，能通過EPR效應靶向到達腫瘤組織，并在基質金屬蛋白酶(MMPs)作用下裂解PP釋放DOX。上述體外模擬釋藥實驗結果證實，該納米粒能在MMP-2作用下成功釋藥。細胞毒性實驗結果說明，加入MMP-2酶組納米粒對A549細胞的抑制率明顯優(yōu)于未加酶組，進一步證實了該納米粒在MMP-2酶的作用下能夠酶解釋藥，并發(fā)揮DOX抗腫瘤效果。此外，我們以AP作為藥物載體，不僅能很好的載藥，還能發(fā)揮其本身的抗腫瘤和免疫調節(jié)作用，有利于腫瘤的治療，這將通過后期免疫學實驗及動物實驗加以證實。

本實驗設想將AP既作為納米遞藥體系的載體材料，又作為效應分子發(fā)揮其免疫調節(jié)作用，與化療藥物共同構建酶敏腫瘤靶向納米遞藥體系，實現DOX靶向殺傷腫瘤細胞和AP改善腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)的協同抗腫瘤作用，更有利于腫瘤的治療和機體的康復，為腫瘤的治療提供了新思路。

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