王洪彬 ，李永慧 ，朱利霞 ，吳同壘 ，張志強 ，高桂生 ，史秋梅

（1.河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北 秦皇島 066604；2.秦皇島第二醫(yī)院，河北 秦皇島 066604）

舌鰨Cynoglossus sp.營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)膩、味道鮮美，廣受消費者喜愛，是名貴的海水養(yǎng)殖魚類之一。隨著海水養(yǎng)殖舌鰨規(guī)模的擴大，各種細(xì)菌性疾病也隨之而來，其中由嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila引起的細(xì)菌病最為嚴(yán)重。嗜水氣單胞菌是一種常見的條件致病菌[1,2]，能夠引起多種淡水魚、蛙、哺乳動物以及海水養(yǎng)殖魚類的敗血癥、皮膚潰瘍、腹瀉等疾病[3]。有資料顯示，該菌還是一種嚴(yán)重的“人-畜-魚”共患菌[4]，研究該菌具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

近年來，由于魚類養(yǎng)殖中大量使用、濫用抗生素和化學(xué)藥物，導(dǎo)致水體養(yǎng)殖環(huán)境惡化，也產(chǎn)生了耐藥性菌株，水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類免疫力下降，抗病能力減弱，甚至嚴(yán)重威脅人類的健康和食品安全。中草藥取材方便、價格低廉，含多種生物活性物質(zhì)，如有機酸類、生物堿類等，可調(diào)節(jié)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的免疫力，能夠增強魚類的抗菌、抗病能力等[5]，越來越被人們所接受。從中草藥中篩選出具有更強抗菌能力的藥物受到了極大的重視[6]。本試驗選取板藍(lán)根、連翹、訶子等24味中草藥，采用水提法提取中藥材有效成分，測定這24味中草藥水提物對舌鰨源嗜水氣單胞菌的抑菌效果，為進一步篩選出具有明顯抑菌作用的中草藥和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株：舌鰨源嗜水氣單胞菌為本實驗室提供，編號為A.H QHD-1。

24種中草藥是：訶子、蘇木、艾葉、石榴皮、厚樸、蒲公英、馬齒莧、知母、決明子、桔梗、龍膽草、青皮、苦參、郁金香、香附、防風(fēng)、荊芥、黃柏、連翹、黃芩、夏枯草、紫花地丁、板藍(lán)根和女貞子，購自秦皇島民樂醫(yī)藥。營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

試驗儀器有：G1040WS-立式自動壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；無菌工作臺，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；冰箱，青島海爾特種電冰箱有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；常規(guī)試劑與儀器均等由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗菌株菌液的制備

從-80℃冰箱中取出舌鰨源嗜水氣單胞菌，接種于普通的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)過夜。無菌挑取嗜水氣單胞菌單個菌落，接種于含有4mL營養(yǎng)肉湯的試管培養(yǎng)基中，置于28℃180r/min搖床，搖菌12h。用平板菌落計數(shù)法確定菌液濃度，使菌液最終稀釋至1×108cfu/mL。

1.2.2 單味中草藥藥液制備

根據(jù)參考文獻[7]中報道的水提法，并略加改動，提取連翹、知母、訶子等24味中草藥有效成分。先稱取定量的中草藥原料，除去雜質(zhì)，清洗，干燥。粉碎后，每種中草藥稱取40g倒入燒杯中，加入400mL水浸泡1h。然后煎煮，邊煮邊攪拌，連煮2次，冷卻并過濾，離心后濃縮至40mL，使藥液終濃度為1g/mL，分裝后121℃滅菌10min，分裝并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 中草藥對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果Tab.1 The in vitro bacteriostatic effects of Chinese herbal medicines on Aeromonas hydrophila

1.2.3 中草藥體外抑菌圈直徑的測定

[8]中的瓊脂平板打孔法測定。抑菌圈直徑≥20mm為極敏，20mm＞抑菌直徑≥15mm為高敏，15mm＞抑菌圈直徑≥10mm為中敏，10mm以下為低敏[9]。

1.2.4 中草藥最小抑菌濃度（MIC）的測定

按參考文獻[10]略加改動，用試管二倍稀釋法測定MIC。先將11只試管標(biāo)號1～11，每管加入2mL 2×的營養(yǎng)肉湯；在第2個管中加入2mL的藥液（1g/mL），混合均勻后吸取2mL到第3管里，依次重復(fù)直到第9管，從第9管吸取2mL到第11管混合均勻后棄去2mL，第10管不加藥作為陽性對照；第1～10管各加入10μL菌液（菌液濃度1×108cfu/mL），第11管不接菌為陰性對照。每種藥物3個重復(fù)，28℃培養(yǎng)24h。利用平板分區(qū)劃線法，無菌棉簽蘸取不同稀釋度的培養(yǎng)液涂板，28℃培養(yǎng)12h后觀察結(jié)果。無菌生長時的藥物濃度為該藥的MIC。

表2 不同中草藥對嗜水氣單胞菌的MICTab.2 The minimum inhibitory concentration （MIC）of different Chinese herbal medicines on Aeromonas hydrophila

2 結(jié)果與分析

由表1可知：舌鰨源嗜水氣單胞菌對訶子、蘇木、夏枯草、青皮這4種中草藥極敏感；對黃芩、板藍(lán)根、厚樸、紫花地丁高度敏感；對女貞子、苦參、荊芥中度敏感；對黃柏、龍膽草、知母、防風(fēng)、決明子、郁金香、馬齒莧、艾葉、石榴皮、桔梗低敏感。建議在水產(chǎn)養(yǎng)殖中聯(lián)合使用訶子和青皮，以達(dá)到更好的治療效果。

由表2可知：訶子和夏枯草對舌鰨源嗜水氣單胞菌的MIC為31.25mg/mL,；蘇木、青皮對該菌的MIC為62.5 mg/mL；紫花地丁、厚樸對該菌的MIC為125 mg/mL；黃芩、板藍(lán)根、女貞子、蒲公英對該菌的MIC為250 mg/mL；香附、苦參、荊芥對該菌的MIC為500 mg/mL；黃柏、龍膽草等中草藥沒有抑菌效果。每味中草藥對舌鰨嗜水氣單胞菌的MIC不同，生產(chǎn)中可以據(jù)此合理調(diào)整，減少藥物的濫用和浪費，提高經(jīng)濟效益。

3 討論

近年來，嗜水氣單胞菌等造成的海水養(yǎng)殖細(xì)菌病逐年增加，大都采用抗生素治療這些細(xì)菌性疾病[11]?？股胤揽亓瞬≡腥?，也導(dǎo)致了耐藥菌株的出現(xiàn)[12]。1957年美國首次觀察到耐磺胺藥物殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida，該菌引起了虹鱒的大規(guī)模感染、死亡；1971年在日本大麻哈魚Oncorhynchus keta體內(nèi)檢測到耐磺胺藥物和氯霉素的殺鮭氣單胞菌；20世紀(jì)80年代末，多重耐藥性嗜水氣單胞菌的出現(xiàn)導(dǎo)致淡水魚患嚴(yán)重的細(xì)菌性敗血癥在全國范圍內(nèi)流行，都表明了多種致病菌產(chǎn)生了單一或者多重耐藥性[13]。此外，抗生素在水產(chǎn)品中高殘留，導(dǎo)致接觸人體耐藥菌增加，耐藥性逐漸增強?？傊?，抗生素以及化學(xué)藥物的濫用、誤用等造成了海水養(yǎng)殖環(huán)境的惡化；大量致病性耐藥菌株的出現(xiàn)，使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大經(jīng)濟損失；食品中抗生素高殘留，極大威脅了人類的健康。

中草藥具有特殊的抗病原微生物機制，治療細(xì)菌性疾病效果較好[14]。研究表明，中草藥主要通過調(diào)動機體內(nèi)的積極因素來減弱細(xì)菌對組織的破壞以及降低細(xì)菌毒力等方式來發(fā)揮抑菌作用[14]。如豬苓、黃芪等中草藥可以提高外周血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率、增加雞淋巴細(xì)胞花環(huán)的形成等。然而，部分中草藥的抗菌機制主要通過對菌體直接發(fā)揮作用而達(dá)到抑菌和殺菌作用，如大蒜分子中含有的氧原子可與半胱氨酸分子中細(xì)菌生長繁殖所必需的巰基結(jié)合，使巰基變成了非活性物質(zhì)，極大抑制了細(xì)菌的生長繁殖。

相關(guān)文獻顯示，中草藥防治嗜水氣單胞菌性細(xì)菌病比抗生素具有明顯的獨特優(yōu)勢[15]。中草藥是中國醫(yī)學(xué)瑰寶，是提高防病治病水平、增加經(jīng)濟效益以及發(fā)展綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康的需要[5,16]；中草藥具有抗菌、抗病作用，如黃芩、黃柏等能夠抗菌、調(diào)節(jié)機體自身免疫，增強免疫力等[17,18]；中草藥無藥殘、抗藥性不顯著、來源廣泛、無公害等，應(yīng)用中草藥防治魚病越來越引起科研工作者的關(guān)注[16]。黃岑、訶子具有廣泛的抑菌譜，應(yīng)用廣泛。這兩種中草藥對大腸桿菌Escherichia coli、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa均有一定的抑菌作用[19]，本試驗也顯示嗜水氣單胞菌對這兩種中藥極為敏感，其中訶子對嗜水氣單胞菌的抑菌作用最強，這與陶健等[15]、羅新等[20]的研究結(jié)果一致。訶子內(nèi)含有糖類、多種氧化酶等，具有廣泛的藥理作用。厚樸多用于臨床治療細(xì)菌性疾病、炎癥等，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、日本漢方醫(yī)學(xué)已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[20]。嗜水氣氣胞菌對連翹表現(xiàn)耐藥，這與陳曉利等[10]試驗結(jié)果不同，其主要原因可能在于菌株分離、來源地、基因以及中草藥煎煮方法等不同。本研究選取“人-畜-魚”共患-嗜水氣單胞菌，進行體外抑菌試驗，旨在篩選出對嗜水氣單胞菌有較強抑制作用的中草藥，為中草藥臨床治療由嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌病提供了重要理論參考。中草藥成分復(fù)雜，有效成分和抗菌機制、作用機理有待進一步研究。

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