， ，

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所,腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421001；2.郴州市第一人民醫(yī)院病理科)

喉癌相關(guān)基因(Laryngeal cancer related gene，LCRG1)是課題組前期采用mRNA差異顯示和cDNA文庫篩選技術(shù)克隆的一個(gè)新基因(GenBank：AF268387)[1-3]。LCRG1由6個(gè)外顯子[1,4]和8個(gè)內(nèi)含子組成[2]，編碼一個(gè)具有288個(gè)氨基酸殘基并含蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)，且與已知蛋白質(zhì)無顯著同源性[1]。LCRG1定位于參與喉癌最常見的雜合性缺失(Loss of heterozygosity，LOH)區(qū)域的抑瘤基因所在的17q12～21.1染色體上， D17s800～D17s930位點(diǎn)之間[1]。在40%的原發(fā)性喉癌組織中LCRG1表達(dá)缺失或下調(diào)[3-4]，能抑制喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖以及腫瘤形成[1]。目前國(guó)內(nèi)外尚無LCRG1單克隆抗體，本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)LCRG1的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原表位，擬構(gòu)建LCRG1真核表達(dá)載體,并使其在HEK293細(xì)胞中獲得表達(dá),進(jìn)而純化LCRG1蛋白，能為制備單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1生物信息學(xué)分析

1.1.1 喉癌相關(guān)基因的蛋白氨基酸序列 人LCRG1蛋白的氨基酸序列(由基因組序列推導(dǎo))共有288個(gè)氨基酸殘基,檢索自GenBank NO.AF268387,見圖1。

MARLVAVCRDGEEEFPFERRQIPLYIDDTL
TMVMEFPDNVLNLDGHQNngAQLKQFIQRH
GMLKQQDLSIAMVVTSREVLSALSQLVPCV
GCRRSVERLFSQLVESGNPALEPLTVGPKG
VLSVTRSCMTDAKKLYTLFYVHGSKLNDMI
DAIPKSKKNKRCQLHSLDTHKPKPLGGCWM
DVWELMSQECRDEVVLIDSSCLLETLETYL
RKHRFCTDCKNKVLRAYNILIGELDCSKEK
GYCAALYEGLRCCPHERHIHVCCETDFIAH
LLGRAEPEFAGGYEYVIC

圖1人LCRG1蛋白的氨基酸序列

1.1.2 喉癌相關(guān)基因的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用Garnier-Robson,Chou-Fasman和Karplus-Schultz方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。所有計(jì)算由DNAstar軟件包中的Protean程序完成。

1.1.3 喉癌相關(guān)基因的蛋白抗原表位預(yù)測(cè) 以7個(gè)氨基酸殘基為一組,按Kyte-Doolittle的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn)和Hopp&Woods方法,分別預(yù)測(cè)其親水性；按Emini方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的表面可能性；按Jameson-Wolf方法預(yù)測(cè)抗原性指數(shù)。所有計(jì)算由DNAstar軟件包中的Protean程序完成。

1.2 V152H-LCRG1質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 設(shè)計(jì)用于喉癌相關(guān)基因和載體V152H的引物

引物送蘇州金唯智生物科技有限公司合成，LCRG1-F：ATAGCTAGCAATGGCGCGACTCGTGGCA，LCRG1-R:CGGGATCCGCAAATTACATACTCATACCCTCCTGC，V152H-F： TGATCAAGCTTCTGCCTGC，V152H-R：CATTACTTGTCATCGTCGTCCTTG。

1.2.2 喉癌相關(guān)基因片段的擴(kuò)增 以正常喉黏膜cDNA為模板，通過PCR克隆LCRG1基因序列。在0.2 mL無酶EP管中依次加入10×Pfu Buffer(含有 Mg2+)5 μL， 2.5 mmol/L dNTP混合液4 μL，LCRG1-F/R，V152H-F/R引物各1 μL，模板DNA 0.2 μL，Pfu 1 μL，ddH2O 35.8 μL，PCR反應(yīng)體積共50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并拍照記錄。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化 (1)向盛放目標(biāo)膠塊的離心管中加入400 μL Buffer DE-A，混合均勻后于75 ℃加熱，間斷混合，直至凝膠塊完全熔化。(2)加入200 μLBuffer DE-B，混合均勻。(3)將第二步形成的混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管，并置于2mL離心管。12 000 rpm，離心1 min，棄濾液。(4)將制備管放回2 mL離心管，加500 μL Buffer W1，12 000 rpm，離心30 s，棄濾液。(5)將制備管繼續(xù)放回2 mL離心管，加700 μL Buffer W2，12 000 rpm離心30 s，棄濾液。以同樣的方法再加入700 μL Buffer W2洗滌一次，12 000 rpm，離心1 min，棄濾液。(6)將制備管置回2 mL離心管中，12 000 rpm，離心2 min。⑺將制備管放入1.5 mL離心管中，在制備膜中央加入25 μL預(yù)熱的65 ℃的無菌去離子水，室溫靜置1 min。最后，12 000 rpm，離心1 min，洗脫DNA。

1.2.4 雙酶切目的基因和載體 NheI和BamHⅠ酶切(同時(shí)取1μg V152H載體質(zhì)粒同步酶切)，使用Fermentas公司的快酶。 酶切體系如下：10×FD Buffer 5μL，NheI 1.5 μL，BamHⅠ1.5 μL，37 ℃酶切2 h，LCRG1回收產(chǎn)物400 ng，無菌水補(bǔ)足50 μL；10×FD Buffer 5 μL，NheI 1μL，BamHⅠ 1 μL，37 ℃酶切2 h，V152H 1 μg，無菌水補(bǔ)足50 μL。

1.2.5 Axygen PCR清潔試劑盒回收酶切產(chǎn)物 (1)在酶切反應(yīng)液中，加入150 μL的Buffer PCR-A，混勻后，轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，12 000 rpm，離心1 min，棄濾液。(2)依次將制備管放回2 mL離心管中，并分別加700 μL Buffer W2和400 μL Buffer W2，12 000 rpm，離心1 min，棄濾液。(3)最后將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中，在制備管膜中央加入25 μL預(yù)熱65 ℃的ddH2O，室溫靜置1 min，12 000 rpm，離心1 min，洗脫DNA。

1.2.6 目的基因片段與載體的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定 (1)目的基因與載體體積按5∶1混合，在10 μL反應(yīng)體系中，20 ℃連接2 h。(2)取5μL連接產(chǎn)物與60 μL TOP10感受態(tài)細(xì)胞混勻，置于冰上冰浴30 min。(3)42 ℃熱沖擊90 s，立即冰上放置2 min。(4)超凈臺(tái)內(nèi)加入500 μL無抗性的LB培養(yǎng)液，37 ℃、180 rpm搖床孵育1 h。(5)1 h后涂Amp抗性LB平板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。(6)挑取轉(zhuǎn)化板的單克隆，置于10 μL無菌水中重懸，取1 μL菌液作模板，應(yīng)用引物V152F/R進(jìn)行PCR鑒定。并將重組質(zhì)粒命名為V152H-LCRG1。

1.3 V152H-LCRG1轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞與表達(dá)鑒定(1)制備密度>1×108個(gè)/mL的人胚腎HEK293細(xì)胞懸液備用。(2)用稀釋液將100 μg質(zhì)粒稀釋至1 mL，輕輕混勻。(3)用稀釋液稀釋200 μL LipofectamineTM2000至終體積為1 mL，輕輕混勻，室溫放置5 min。(4)將第二步與第三步的液體混合，并輕輕混勻，室溫孵育30 min。(5)將第一步制備的HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)移到500 mL搖瓶中，加入新鮮預(yù)熱的 ExpressionMedium至終體積為98 mL。(6)加入2 mL孵育后的DNA-LipofectamineTM2000混合物，在含8%CO2濃度的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，以125 rpm培養(yǎng)。(7)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)物，SDS-PAGE電泳進(jìn)行表達(dá)鑒定。

1.4喉癌相關(guān)基因的蛋白真核表達(dá)與純化(1)在含8%CO2濃度的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，以125 rpm培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，并進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。(2)轉(zhuǎn)染后7天，1200 rpm，離心5 min，收集細(xì)胞。(3)樣品準(zhǔn)備：4 ℃，離心收集表達(dá)上清。離心上清中加入binding buffer以調(diào)整樣品的成分。0.45 μm濾膜處理，準(zhǔn)備上樣。(4)平衡：10個(gè)柱體積的binding buffer平衡鎳柱。(5)上樣：0.45 μm濾膜處理好的樣品全部上樣。(6)洗雜：20個(gè)柱體積binding buffer洗雜，直至無物質(zhì)流出。(7)洗脫1:5個(gè)柱體積elution buffer洗脫，收集洗脫產(chǎn)物。(8)洗脫2:5個(gè)柱體積elution buffer洗脫，收集洗脫產(chǎn)物。(9)洗脫產(chǎn)物通過SDS-PAGE檢測(cè)。(10)透析與濃縮：洗脫產(chǎn)物透析到PBS(pH7.4)溶液中，并濃縮。

2 結(jié) 果

2.1 Garnier-Robson、Chou-Fasman和Karplus-Schultz方法預(yù)測(cè)喉癌相關(guān)基因的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)本研究利用分子生物信息學(xué)中Garnier-Robson、Chou-Fasman方法共同預(yù)測(cè)人LCRG1的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)，β-折疊結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，用Garnier-Robson方法預(yù)測(cè)無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(Chou-Fasman方法無該預(yù)測(cè)功能)，Karplus-Schultz方法預(yù)測(cè)柔性區(qū)域，結(jié)果如表1所示。其中，α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)與抗體較難嵌合，故不作為抗原表位。而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)中的柔性區(qū)域，一般出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表位，能更好的與抗體嵌合，極可能成為抗原表位[5]。因此，本研究柔性區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果(包括Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)角區(qū)域、Garnier-Robson方法預(yù)測(cè)的無規(guī)則卷曲區(qū)域、Karplus-Schultz方法預(yù)測(cè)的柔性區(qū)域)以及這些區(qū)域的鄰近157,159區(qū)域都具有成為抗原表位的可能性。

表1 分子生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的人LCRG1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

G:Garnier-Robson 方法；C:Chou-Fasman方法；共:Garnier-Robson和Chou-Fasman兩種方法所預(yù)測(cè)的相同區(qū)段；K:Karplus-Schultz方法預(yù)測(cè)

2.2 Kyte-Doolittle方法、Hopp&Woods方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法預(yù)測(cè)喉癌相關(guān)基因的蛋白抗原表位以7個(gè)氨基酸殘基為一組,按Kyte-Doolittle的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn)和Hopp&Woods方法,分別預(yù)測(cè)其親水性；按Emini方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的表面可能性；按Jameson-Wolf方法預(yù)測(cè)抗原性指數(shù)。結(jié)果如表2所示。綜合抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果中親水性指數(shù)，抗原指數(shù)，表面可能性指數(shù)均較高的區(qū)域有9-22，41-52，91-100，103-110，125-134，145-148，151-163，166-177，187-192，209-225，235-242，251-259，273-282等13個(gè)區(qū)域。

表2 LCRG1蛋白的抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

K：Kyte-Doolittle方法；H：Hopp&Woods方法；共：Kyte-Doolittle和Hopp&Woods兩種方法預(yù)測(cè)的相同區(qū)段；E：Emini方法；J：Jameson-Wolf方法

2.3喉癌相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增利用PCR，以正常喉黏膜cDNA為模板，擴(kuò)增后得到約867 bp大小的目的條帶。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 以正常喉黏膜cDNA為模板的PCR產(chǎn)物A：PCR產(chǎn)物；B：PCR分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000)

2.4重組V152H-LCRG1質(zhì)粒的構(gòu)建將目的基因片段與載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，再通過PCR鑒定得到陽性克隆，最后將驗(yàn)證正確的克隆送往金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示測(cè)序正確，如圖3所示。

圖3 V152H-LCRG1質(zhì)粒構(gòu)建PCR克隆驗(yàn)證及測(cè)序A：PCR分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000)；B：重組V152H-LCRG1質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；C：驗(yàn)證測(cè)序條帶

2.5喉癌相關(guān)基因的重組蛋白表達(dá)與純化通過將LCRG1重組質(zhì)粒V152H-LCRG1轉(zhuǎn)染到人胚腎HEK293細(xì)胞獲得真核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+2NTA柱層析純化，進(jìn)而得到純度>95%的目的蛋白，如圖4所示。

圖4 LCRG1重組蛋白的真核表達(dá)與純化A:Marker；B;上樣；C：洗雜；D：洗脫1；E：洗脫2.

3 討 論

喉癌是常見的上呼吸道惡性腫瘤，在呼吸系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率僅次于鼻咽癌[6]。喉癌對(duì)放化療敏感度低，早期喉癌患者可經(jīng)一種或多種方案得到有效治療，但大多數(shù)晚期患者因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而亡[2]。盡管近年來喉保留功能措施取得不少成就，但患者的長(zhǎng)期生存率卻未得到明顯改善[6-7]。眾所周知，喉癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因、抑癌基因失衡有關(guān)[8]。但目前對(duì)喉癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制依然知之甚少。因此，探索喉癌相關(guān)基因的功能研究將為喉癌的靶向治療開辟新途徑。

喉癌相關(guān)基因是喉癌候選抑瘤基因，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和腫瘤的形成，在喉癌組織中表達(dá)下調(diào)[3]。基因轉(zhuǎn)錄水平失調(diào)是腫瘤相關(guān)基因表達(dá)異常的常見機(jī)制之一[9]。課題組前期對(duì)LCRG1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行了相關(guān)研究，明確了LCRG1基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-169至﹢127位點(diǎn)，全長(zhǎng)共含296 bpDNA片段[8]。且研究表明，該核心啟動(dòng)子區(qū)域是基因轉(zhuǎn)錄必不可少的啟動(dòng)子序列[9]。另外，Northern Blot結(jié)果顯示LCRG1在人心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、胰等組織中都具有長(zhǎng)約3.4 kb的轉(zhuǎn)錄本，在心臟和胰腺組織中表達(dá)豐富[1,10]。為了明確LCRG1在喉癌中表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制，Northern印跡分析和PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)分析分別表明基因缺失、基因重排以及編碼區(qū)突變都不是LCRG1在喉癌中表達(dá)下調(diào)的原因[11]。不過，LCRG1 基因啟動(dòng)子甲基化分析卻表明LCRG1基因啟動(dòng)子甲基化可能參與LCRG1基因的表達(dá)調(diào)控[11]。因此，LCRG1基因在喉癌中表達(dá)下調(diào)或缺失除了自身調(diào)控機(jī)制外，可能與其上下游信號(hào)通路，尤其與上游調(diào)控分子有關(guān)。但課題組前期利用已知的公認(rèn)數(shù)據(jù)庫對(duì)LCRG1進(jìn)行分析，沒有發(fā)現(xiàn)任何已知基因和蛋白質(zhì)與LCRG1具有顯著同源性[10]。這說明LCRG1是一個(gè)功能未知的新基因。因此，純化LCRG1蛋白，制備LCRG1抗體有利于LCRG1基因更多的功能研究。

蛋白質(zhì)抗原表位的預(yù)測(cè)有利于合成多肽疫苗，制備診斷試劑和篩選單克隆抗體[5]。重組蛋白是應(yīng)用重組DNA或重組RNA技術(shù)，獲得連接有可以翻譯成目的蛋白的基因片段的重組載體并通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入可以表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞，使之表達(dá)特定的重組蛋白分子的蛋白質(zhì)。伴隨基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，重組功能性蛋白的市場(chǎng)需求日益加大，重組蛋白技術(shù)日趨成熟，再加上重組蛋白可以通過大規(guī)模制備而源源不斷地獲得，使其有望成為藥物分子的靶標(biāo)治療[12]。純化重組蛋白有助于抗體的生產(chǎn)和藥物試劑的開發(fā)[13]。因此，獲得大量高度純化且正確折疊的蛋白質(zhì)顯得尤為重要[14]。

本研究從LCRG1蛋白層面入手，用分子生物信息學(xué)預(yù)測(cè)LCRG1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原表位，不僅可以加深對(duì)LCRG1蛋白的認(rèn)識(shí)，還能為制備LCRG1單克隆抗體提供理論依據(jù)。另外，本研究通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以及PCR驗(yàn)證成功構(gòu)建V152H-LCRG1質(zhì)粒，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入人胚腎HEK293細(xì)胞中，從而獲得LCRG1重組蛋白真核表達(dá)。之后經(jīng)上樣，洗雜，洗脫等步驟將LCRG1重組蛋白進(jìn)一步純化，得到純度>95%的目的蛋白。這不僅為進(jìn)一步制備能用于臨床病理標(biāo)本免疫組化的單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)，也有利于后期對(duì)LCRG1蛋白進(jìn)行更多的功能研究，從而為喉癌的靶向治療開辟新途徑。

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