槲皮素-3-氧-?；サ暮铣杉捌渖锘钚?/h1>
2018-03-21 07:47:53高海立
浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年3期
汪 雷，馬 琛，高海立，徐 濤
(浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018)
槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮)是一種黃酮醇類化合物，廣泛存在于洋蔥、蘋果、槐米等植物中[1-4]。槲皮素具有抗氧化[5]、抗炎[6]、舒張血管[7]、降血壓[8]、抗腫瘤[9-11]等多種生物活性，其抗腫瘤活性現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[12]。然而，槲皮素口服的生物利用度較低。作為一種先導(dǎo)化合物，對(duì)槲皮素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可得到許多高活性的槲皮素衍生物，槲皮素酯就是其中重要的一類[13]。槲皮素屬于多官能團(tuán)化合物，存在多個(gè)可以修飾的位點(diǎn)，本文重點(diǎn)討論其3位羥基的修飾。
Domingo等[14]合成的槲皮素-3-氧-乙酰酯、Saija等[15]合成的槲皮素-3-丙酸酯等酯類化合物，均具有較好的抗氧化性和光保護(hù)性，可以作為光保護(hù)劑的候選化合物。與母核槲皮素相比，槲皮素3位用短鏈取代能改善其水溶性。Gatto等[16]合成了8個(gè)槲皮素-3-氧-酰酯衍生物。與槲皮素相比，槲皮素-3-氧-?；ヮ愌苌锟辊ッ富钚砸撸揖哂休^好的藥代動(dòng)力學(xué)特性，是一種潛在的新型抗菌藥。此外，槲皮素3位酯化修飾產(chǎn)物可以成為槲皮素的前藥。Montenegro等[17]對(duì)槲皮素3位進(jìn)行酯化修飾，其中2個(gè)槲皮素3位酰酯類衍生物具有合適的脂/水分配系數(shù)，在水中穩(wěn)定，能迅速被酶水解釋放出槲皮素，是一種新型槲皮素前藥。Thapa等[18]合成了槲皮素-3-氧-沒食子酸酯，具有抵抗流感A型病毒的活性。與槲皮素相比，槲皮素3位以N,N-二甲基氨基甲酰基取代，其水溶性增強(qiáng)14倍，且不易發(fā)生非酶水解，是一種新型的槲皮素前藥[19]。Huang等[20]對(duì)槲皮素3-位羥基進(jìn)行氨基酸酯化修飾，得到15種槲皮素-3-氧-氨基酸酯，能高選擇性地抑制酪氨酸激酶。Fraisse等[21]合成的槲皮素-3-氧-苯基異氰酸酯，能有效抑制慢性骨髓白血病細(xì)胞K562和結(jié)腸癌細(xì)胞CT26的增殖，藥效分別是槲皮素的73倍和308倍。
本研究以蘆丁為原料，以芐氯對(duì)其7位、3′位和4′位(圖1)羥基進(jìn)行芐基化保護(hù)，然后在酸性醇溶液中水解脫去蘆丁糖，得到中間體1(7,3′,4′-氧-三芐基槲皮素)，中間體1與羧酸發(fā)生Steglich酯化反應(yīng)，進(jìn)一步脫去芐基后得到槲皮素酯類衍生物，共合成得到7個(gè)目標(biāo)化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁、質(zhì)譜確證。通過抗氧化和抗腫瘤活性試驗(yàn)，從中篩選出活性優(yōu)于槲皮素的化合物，并對(duì)構(gòu)效關(guān)系作初步總結(jié)。
圖1 槲皮素的結(jié)構(gòu)
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
UV2550紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津；iS10 FT-IR紅外光譜儀，美國(guó)尼高力；400 MHz核磁共振儀，美國(guó)Brucker；Esquire3000質(zhì)譜儀，美國(guó)Brucker；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。
槲皮素、蘆丁，河南平輿馨星生化有限公司。氯化芐，重蒸供用。二氯甲烷，加入氫化鈣回流2 h，蒸餾，密封備用。1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)，上海晶純?cè)噭┯邢薰?；鄰二氮菲，天津市化學(xué)試劑三廠。所用試劑和溶劑均為分析純。
1.2 方法
1.2.1 清除羥基自由基
按文獻(xiàn)[22]方法，有所修改。損傷管的加樣順序如下：在10 mL具塞試管中依次加入1 mL 0.75 mmol·L-1鄰二氮菲水溶液、2 mL 0.15 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)和0.5 mL蒸餾水，混勻。然后加入新鮮配制的0.75 mmol·L-1的FeSO4溶液1 mL，混勻，再加入0.01%的過氧化氫1 mL，37 ℃水浴保溫60 min后，在536 nm測(cè)吸光值(D0)。樣品管加樣順序同上所述，僅以0.5 mL供試液替代損傷管中的蒸餾水，在536 nm處測(cè)吸光值(D1)。未損傷管加樣順序同樣品管，但以1 mL蒸餾水代替損傷管中0.01%過氧化氫，于536 nm處測(cè)吸光值(D2)。以槲皮素為陽性對(duì)照。計(jì)算自由基清除率(ROH)及自由基半數(shù)清除率(SC50)。
ROH=100(D1—D0)/(D2—D0)。
1.2.2 清除DPPH自由基
參照文獻(xiàn)[23]方法，在5 mL具塞試管中加入供試液1 mL，再加入3 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH溶液，搖勻，避光放置30 min，在517 nm處測(cè)吸光值Dy。空白對(duì)照組加樣順序同上，僅以1 mL無水乙醇替代供試液，測(cè)吸光值為Ds，供試液組加樣順序同上，僅以3 mL無水乙醇溶液替代DPPH溶液，測(cè)吸光值為DT，計(jì)算DPPH自由基清除率(RDPPH)及SC50。
RDPPH=100[1—(Dy—DT)/Ds]。
1.2.3 細(xì)胞試驗(yàn)
用MTT法檢測(cè)不同濃度槲皮素及其酯類化合物對(duì)EC109細(xì)胞、MGC-803細(xì)胞、EC9706細(xì)胞、PC-3細(xì)胞增殖的抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，試驗(yàn)組加入RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的槲皮素酯類衍生物至終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μg·mL-1，溶劑對(duì)照組中加入培養(yǎng)基，每孔終體積為200 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。72 h后，取出培養(yǎng)板于倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照。每孔再加入20 μL 5 mg·mL-1MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去原培養(yǎng)液后，用PBS清洗每孔，每孔各加入150 μL DMSO，晃勻使沉淀溶解，室溫下靜置約20 min(溶液呈紫紅色)，將96孔板置于酶標(biāo)儀上在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔光密度值，計(jì)算各組的生長(zhǎng)抑制率及半抑制濃度(IC50)。
1.3 化合物合成
1.3.1 中間體1(7,3′,4′-氧-三芐基槲皮素)的合成
按文獻(xiàn)[24]的方法，有所改進(jìn)。取蘆丁2.44 g(4.0 mmol)溶于20 mL 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1.93 g(14.0 mmol)無水碳酸鉀和催化劑碘化鉀攪拌，冰浴條件下，緩慢滴加1.6 mL(14.0 mmol)新蒸餾的氯化芐，緩慢升溫至室溫，攪拌過夜(約12 h)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。待反應(yīng)完全，加入冰醋酸將反應(yīng)液調(diào)至pH值6，再向其中加入200 mL蒸餾水，有大量沉淀析出，繼續(xù)攪拌1 h后，沉淀聚集于瓶底，棄去上清液。向沉淀中加入60 mL 95%乙醇，水浴加熱至固體完全溶解，一次性加入10 mL濃鹽酸，加熱回流，15 min后開始有黃色沉淀產(chǎn)生，1 h后反應(yīng)結(jié)束。冷卻，冰箱放置過夜，過濾，烘干，得粗品，用三氯甲烷/甲醇重結(jié)晶，干燥，得到黃色固體，產(chǎn)率78%。熔點(diǎn)(M.p)：188.3～190.1 ℃(文獻(xiàn)值188～190 ℃[24])。1H核磁共振(1H NMR)(400 MHz, DMSO)δ 12.42 (s, 1H, 5-OH)，9.72 (s, 1H, 3-OH)，7.90 (s, 1H, 2′-H)，7.85 (d,J=8.7 Hz, 1H, 6′-H)，7.32～7.40 (m, 15H, 3×OCH2C6H5)，7.25 (d,J=8.7 Hz, 1H, 5′-H)，6.67 (d,J=2.1 Hz, 1H, 8-H)，6.26 (d,J=2.1 Hz, 1H, 6-H)，5.21 (s, 4H, 2×OCH2C6H5)，5.11 (s, 2H, OCH2C6H5)。紅外光譜(IR)(KBr)：3 290、1 651、1 616、1 593、1 504、1 455、1 306、1 258、997、749 cm-1。
1.3.2 槲皮素酯類衍生物(3)的合成
槲皮素-3-氧-乙酸酯(3a)的制備。取7,3′,4′-氧-三芐基槲皮素-3-氧-乙酸酯0.614 g(2.0 mmol)溶于二氯甲烷/甲醇混合溶劑中，加入Pd/C(濃度為10%)催化劑0.159 g，室溫0.4 MPa壓力條件下，加氫反應(yīng)6 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾除Pd/C，濾液減壓蒸餾回收溶劑，得到固體，以氯仿-甲醇(體積比20∶1)為洗脫劑，過硅膠柱，得到淡黃色固體，產(chǎn)率60.0%。M.p：196.6～198.2 ℃。電噴霧-質(zhì)譜(ESI-MS)：343 [M-H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.23 (s, 1H, 5-OH)，10.78 (s, 1H, 7-OH)，9.77 (s, 2H, 3′-OH, 4′-OH)，7.35 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.29 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.93 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.48 (d,J=1.9 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=1.9 Hz, 1H, 6-H)，2.35 (s, 3H, CH3CO)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.37，168.49，165.12，161.52，157.05，156.33，149.78，145.95，130.05，120.98，120.06，116.49，115.39，103.89，99.53，94.54，20.78。IR(KBr)：3 327、1 753、1 651、1 602、1 567、1 489、1 357、1 306、1 183、939、793 cm-1。
槲皮素-3-氧-丙酸酯(3b)的制備。制備方法同3a。3b為黃色固體，產(chǎn)率46.0%。M.p：193.7～195.4 ℃。ESI-MS：357.0 [M-H]+，381.1 [M+Na]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.22 (s, 1H, 5-OH)，11.04 (s, 1H, 7-OH)，9.96 (s, 1H, 3′-OH)，9.65 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.28 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.92 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5-H)，6.48 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，2.68 (q,J=7.5 Hz, 2H, CH2COO)，1.15 (t,J=7.5 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 175.78，172.06，164.84，161.58，157.19，156.88，148.95，145.18，129.98，120.81，120.58，115.12，114.77，103.84，98.81，93.73，26.68，7.85。IR(KBr)：3 476、3 127、1 756、1 654、1 604、1 513、1 454、1 367、1 286、1 194、1 086、792 cm-1。
槲皮素-3-氧-丁酸酯(3c)的制備。制備方法同3a。3c為黃色固體，產(chǎn)率62%。M.p：206.6～208.5 ℃。ESI-MS：373.1 [M+H]+，395.1 [M+Na]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.24 (s, 1H, 5-OH)，11.02 (s, 1H, 7-OH)，9.91 (s, 1H, 3′-OH)，9.55 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=1.3 Hz, 1H, 2′-H)，7.27 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.48 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，2.63 (t,J=7.2 Hz, 2H, CH2COO)，1.66 (dd,J=14.6, 7.3 Hz, 2H, CH2CH2COO)，0.95 (t,J=7.4 Hz, 3H, CH3CH2CH2COO)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，170.91，165.07，161.55，157.06，156.46，149.72，145.93，130.03，120.98，120.09，116.39，115.48，103.92，99.51，94.53，35.41，18.33，13.77。IR(KBr)：3 372、3 073、2 968、2 878、1 750、1 735、1 597、1 533、1 449、1 377、1 295、1 197、993、846、603 cm-1。
槲皮素-3-氧-戊酸酯(3d)的制備。制備方法同3a。3d為黃色固體，產(chǎn)率62.5%。M.p：209.6～211.5 ℃。ESI-MS：385.0 [M-H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.23 (s, 1H, 5-OH)，11.03 (s, 1H, 7-OH)，9.91 (s, 1H. 3′-OH)，9.54 (s, 1H, 4′-OH)，7.32 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.48 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，2.64 (t,J=7.3 Hz, 2H, CH2COO)，1.68～1.56 (m, 2H, CH2CH2COO)，1.35 (dd,J=15.0, 7.5 Hz, 2H, CH2CH2CH2COO)，0.89 (t,J=7.3 Hz, 3H, CH3CH2CH2CH2COO)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，171.02，165.07，161.54，157.06，156.48，149.72，145.93，130.03，120.98，120.07，116.37，115.48，103.92，99.51，94.53，33.28，26.85，21.93，14.04。IR(KBr)：3 416、3 301、2 961、2 864、1 748、1 659、1 614、1 513、1 444、1 358、1 239、1 196、1 002、850、594 cm-1。
槲皮素-3-氧-庚酸酯(3e)的制備。制備方法同3a。3e為黃色固體，產(chǎn)率67.1%。M.p：195.9～197.1 ℃。ESI-MS：413.2 [M-H]+，437.1 [M+Na]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.24 (s, 1H, 5-OH)，10.98 (s, 1H, 7-OH)，9.90 (s, 1H, 3′-OH)，9.56 (s, 1H, 4′-OH)，7.32 (d,J=2.1 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.1 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.47 (d,J=1.9 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=1.9 Hz, 1H, 6-H)，2.63 (t,J=7.3 Hz, 2H, CH2COO)，1.70～1.56 (m, 2H, CH2CH2COO)，1.36～1.17 [m, 6H, (CH2)3],0.85 (t,J=6.6 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，171.02，165.07，161.55，157.05，156.48，149.73，145.93，130.03，120.98，120.06，116.33，115.48，103.92，99.50，94.52，33.57，31.33，28.43，24.74，22.42，14.33。IR(KBr)：3 304、2 930、2 857、1 745、1 658、1 612、1 513、1 443、1 357、1 275、1 196、1 002、850 cm-1。
槲皮素-3-氧-壬酸酯(3f)的制備。制備方法同3a。3f為黃色固體，產(chǎn)率60%。M.p：197.3～198.7 ℃。ESI-MS：441 [M-H]+，443 [M+H]+;1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.25 (s, 1H, 5-OH)，10.95 (s, 1H, 7-OH)，9.96 (s, 1H, 3′-OH)，9.61 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.47 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，2.63 (t,J=7.3 Hz, 2H, CH2COO)，1.70～1.56 (m, 2H, CH2CH2COO)，1.27 (dd,J=20.9, 9.8 Hz, 10H, (CH2)5)，0.84 (t,J=6.8 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，171.00，165.08，161.56，157.05，156.45，149.74，145.93，130.04，120.97，120.06，116.33，115.46，103.91，99.50，94.51，33.57，31.67，29.08，29.02，28.76，24.78，22.55，14.42。IR(KBr)：3 415、3 302、2 926、2 855、1 746、1 659、1 614、1 513、1 444、1 359、1 240、1 196、1 002、851、668 cm-1。
槲皮素-3-氧-硬脂酸酯(3g)的制備。制備方法同3a。3g為黃色固體，產(chǎn)率56.9%。M.p：208.3～210.6 ℃。ESI-MS：600 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.24 (s, 1H, 5-OH)，10.98 (s, 1H, 7-OH)，9.83 (s, 1H, 3′-OH)，9.52 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=2.1 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.1 Hz, 1H, 6′-H)，6.90 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.47 (d,J=1.8 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=1.8 Hz, 1H, 6-H)，2.62 (t,J=7.2 Hz, 2H, CH2COO)，1.62 (d,J=7.4 Hz, 2H, CH2CH2COO)，1.49～1.09 (m, 28H, 14×CH2)，0.83 (t,J=6.7 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，170.93，165.08，161.60，157.05，156.42，149.74，145.95，130.08，120.93，120.10，116.32，115.47，103.93，99.49，94.48，33.60，31.77，29.54，29.50，29.41，29.32，29.20，24.78，22.56，14.36。IR(KBr)：3 395、2 981、2 904、1 719、1 682、1 606、1 527、1 440、1 367、1 288、1 182、846、771、700 cm-1。
2 結(jié)果與分析
2.1 反應(yīng)路線設(shè)計(jì)
相關(guān)研究[25]表明，蘆丁溶于DMF，在加熱條件下與氯化芐反應(yīng)3 h，薄層層析(TLC)顯示有多個(gè)斑點(diǎn)，且后處理過程中產(chǎn)生很多褐色的黏稠狀固體。這可能是多元酚在堿性環(huán)境中加熱，發(fā)生了氧化或者聚合的副反應(yīng)。雖然經(jīng)過相關(guān)分離手段也得到了7,3′,4′-氧-三芐基槲皮素，但產(chǎn)率較低。在文獻(xiàn)[26]的基礎(chǔ)上，改進(jìn)試驗(yàn)條件：在室溫下，將蘆丁溶于DMF，加入3.5倍蘆丁質(zhì)量的氯化芐，攪拌反應(yīng)過夜。一方面，可以避免原料自身的聚合反應(yīng)；另一方面，低溫不易破壞5-羥基與4-羰基形成的氫鍵，使得最終產(chǎn)物以三保護(hù)為主，存在少部分二保護(hù)產(chǎn)物。通過氯仿/甲醇重結(jié)晶，得到較純的中間體7, 3′, 4′-氧-三芐基槲皮素。加入羧酸酯化得到圖2中2a～2g，催化氫解脫保護(hù)基得到目標(biāo)產(chǎn)物(圖2中3a～3g)。
2.2 對(duì)羥基自由基的清除能力
從表1可知，除化合物3f和3g外，其余化合物在試驗(yàn)濃度下，對(duì)羥基自由基的清除率均能達(dá)到70%以上，且清除率隨濃度增大呈明顯上升趨勢(shì)。從半數(shù)清除率(SC50)來看，化合物3a和3b的SC50均小于282.5 μmol·L-1，低于母藥槲皮素。并且發(fā)現(xiàn)槲皮素3位以4個(gè)碳以下的短鏈脂肪酸取代，將有利于其活性增強(qiáng)。通過比較化合物3a～3g，發(fā)現(xiàn)隨著脂肪烴碳鏈的延長(zhǎng)，其清除羥基自由基的活性大體呈現(xiàn)出越來越差的趨勢(shì)。
2.3 對(duì)DPPH自由基的清除能力
從表2可知，新合成的7個(gè)槲皮素酯類化合物除3g外，對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除效果，并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。其中，3a、3b、3c的SC50均小于槲皮素的18.8 μmol·L-1。這表明以4個(gè)碳以下的脂肪酸取代槲皮素3位羥基，有利于增強(qiáng)其清除DPPH自由基的能力。
(1)DMF為溶劑，加入碳酸鉀，攪拌下滴加氯化芐；(2)乙醇為溶劑，滴加濃鹽酸；(3)二氯甲烷為溶劑，加入二環(huán)己基碳二亞胺和DMAP；(4)甲醇二氯甲烷溶液(V∶V 1∶1)為溶劑，10%Pd/C為催化劑，催化加氫圖2 槲皮素酯類衍生物的合成路線
化合物取代基團(tuán)不同濃度下對(duì)羥基自由基的清除率/%20mg·L-150mg·L-1100mg·L-1200mg·L-1300mg·L-1SC50/(μmol·L-1)3aCH3CO—11.831.458.677.992.6265.23bCH3CH2CO—15.436.755.382.495.8266.23cCH3CH2CH2CO—5.019.943.381.990.1297.33dCH3(CH2)2CH2CO—1.26.730.156.988.0398.33eCH3(CH2)4CH2CO—5.617.226.666.577.3389.53fCH3(CH2)6CH2CO—6.614.633.547.265.9461.03gCH3(CH2)15CH2CO—1.75.320.342.143.1554.1槲皮素H15.733.865.085.896.3282.5
表2 不同濃度的槲皮素-3-氧-?；ヮ惢衔飳?duì)DPPH自由基的清除率效果
槲皮素的抗氧化活性以B環(huán)上的鄰二酚羥基活性最高。這是因?yàn)楫?dāng)B環(huán)羥基與自由基作用后，產(chǎn)生的自由基可以借助形成分子內(nèi)氫鍵得以穩(wěn)定，而且還可以通過共振形成苯醌，從而降低內(nèi)能，提高穩(wěn)定性。槲皮素酯類衍生物具有清除自由基活性的作用：一方面，歸因于槲皮素所具有的大π鍵共軛體系；另一方面，由于對(duì)槲皮素3位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，保留了槲皮素B環(huán)具有活性的兒茶酚結(jié)構(gòu)，引入的之類取代基，能擴(kuò)大整個(gè)分子的共軛體系，從而穩(wěn)定與自由基反應(yīng)后生成的中間體，因而抗氧化能力得到改善。
2.4 抗腫瘤活性
從表3可知，槲皮素對(duì)EC109和EC9706細(xì)胞的抑制作用相對(duì)較好，而對(duì)其他2種細(xì)胞的IC50值均大于128 μg·mL-1。合成的7種槲皮素酯類衍生物對(duì)這4種癌細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，但總體來看，普遍對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803有較好的抑制作用。構(gòu)效關(guān)系分析表明，槲皮素3位以脂肪鏈取代時(shí)，隨著碳鏈延長(zhǎng)，其對(duì)EC109細(xì)胞的抑制效果增強(qiáng)(圖3)。
雖然新合成的7個(gè)槲皮素酯類化合物對(duì)于人食管癌細(xì)胞EC109的作用均弱于槲皮素，但是普遍對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803表現(xiàn)出較好的抑制作用(表3)。其中化合物3f的IC50可以達(dá)到8.24 μg·mL-1?；衔?b對(duì)人前列腺癌細(xì)胞PC-3的抑制效果最好，IC50達(dá)到6.94 μg·mL-1，明顯優(yōu)于母核槲皮素。槲皮素3位以大于7個(gè)碳原子長(zhǎng)度的脂肪酸取代，有助于提高對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803的抑制作用。
表3 槲皮素-3-氧-酰基酯類化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率
圖3 槲皮素3位取代碳鏈長(zhǎng)短與對(duì)EC109細(xì)胞抑制作用的關(guān)系
3 小結(jié)
以廉價(jià)的蘆丁為原料，利用Williamson反應(yīng)保護(hù)槲皮素7,3′,4′位羥基，經(jīng)酸水解、Steglich酯化、催化加氫脫芐基，合成了7個(gè)槲皮素酯類衍生物，所有化合物均經(jīng)過紅外、核磁、質(zhì)譜確證。與現(xiàn)有的其他路線相比較，該路線具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、適于規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。初步構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素3位以4個(gè)碳以下的短鏈脂肪酸取代有利于增強(qiáng)其抗氧化活性，而以長(zhǎng)鏈脂肪酸取代有利于改善其抗腫瘤活性。采用MTT法評(píng)價(jià)了槲皮素及其7種衍生物對(duì)4種癌細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明，3e和3f對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803的IC50值分別達(dá)9.35和8.24 μg·mL-1，遠(yuǎn)小于槲皮素，有望進(jìn)一步研究成為抗胃癌的候選藥物。
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汪 雷，馬 琛，高海立，徐 濤
(浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018)
槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮)是一種黃酮醇類化合物，廣泛存在于洋蔥、蘋果、槐米等植物中[1-4]。槲皮素具有抗氧化[5]、抗炎[6]、舒張血管[7]、降血壓[8]、抗腫瘤[9-11]等多種生物活性，其抗腫瘤活性現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[12]。然而，槲皮素口服的生物利用度較低。作為一種先導(dǎo)化合物，對(duì)槲皮素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可得到許多高活性的槲皮素衍生物，槲皮素酯就是其中重要的一類[13]。槲皮素屬于多官能團(tuán)化合物，存在多個(gè)可以修飾的位點(diǎn)，本文重點(diǎn)討論其3位羥基的修飾。
Domingo等[14]合成的槲皮素-3-氧-乙酰酯、Saija等[15]合成的槲皮素-3-丙酸酯等酯類化合物，均具有較好的抗氧化性和光保護(hù)性，可以作為光保護(hù)劑的候選化合物。與母核槲皮素相比，槲皮素3位用短鏈取代能改善其水溶性。Gatto等[16]合成了8個(gè)槲皮素-3-氧-酰酯衍生物。與槲皮素相比，槲皮素-3-氧-?；ヮ愌苌锟辊ッ富钚砸撸揖哂休^好的藥代動(dòng)力學(xué)特性，是一種潛在的新型抗菌藥。此外，槲皮素3位酯化修飾產(chǎn)物可以成為槲皮素的前藥。Montenegro等[17]對(duì)槲皮素3位進(jìn)行酯化修飾，其中2個(gè)槲皮素3位酰酯類衍生物具有合適的脂/水分配系數(shù)，在水中穩(wěn)定，能迅速被酶水解釋放出槲皮素，是一種新型槲皮素前藥。Thapa等[18]合成了槲皮素-3-氧-沒食子酸酯，具有抵抗流感A型病毒的活性。與槲皮素相比，槲皮素3位以N,N-二甲基氨基甲酰基取代，其水溶性增強(qiáng)14倍，且不易發(fā)生非酶水解，是一種新型的槲皮素前藥[19]。Huang等[20]對(duì)槲皮素3-位羥基進(jìn)行氨基酸酯化修飾，得到15種槲皮素-3-氧-氨基酸酯，能高選擇性地抑制酪氨酸激酶。Fraisse等[21]合成的槲皮素-3-氧-苯基異氰酸酯，能有效抑制慢性骨髓白血病細(xì)胞K562和結(jié)腸癌細(xì)胞CT26的增殖，藥效分別是槲皮素的73倍和308倍。
本研究以蘆丁為原料，以芐氯對(duì)其7位、3′位和4′位(圖1)羥基進(jìn)行芐基化保護(hù)，然后在酸性醇溶液中水解脫去蘆丁糖，得到中間體1(7,3′,4′-氧-三芐基槲皮素)，中間體1與羧酸發(fā)生Steglich酯化反應(yīng)，進(jìn)一步脫去芐基后得到槲皮素酯類衍生物，共合成得到7個(gè)目標(biāo)化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁、質(zhì)譜確證。通過抗氧化和抗腫瘤活性試驗(yàn)，從中篩選出活性優(yōu)于槲皮素的化合物，并對(duì)構(gòu)效關(guān)系作初步總結(jié)。
圖1 槲皮素的結(jié)構(gòu)
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
UV2550紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津；iS10 FT-IR紅外光譜儀，美國(guó)尼高力；400 MHz核磁共振儀，美國(guó)Brucker；Esquire3000質(zhì)譜儀，美國(guó)Brucker；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。
槲皮素、蘆丁，河南平輿馨星生化有限公司。氯化芐，重蒸供用。二氯甲烷，加入氫化鈣回流2 h，蒸餾，密封備用。1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)，上海晶純?cè)噭┯邢薰?；鄰二氮菲，天津市化學(xué)試劑三廠。所用試劑和溶劑均為分析純。
1.2 方法
1.2.1 清除羥基自由基
按文獻(xiàn)[22]方法，有所修改。損傷管的加樣順序如下：在10 mL具塞試管中依次加入1 mL 0.75 mmol·L-1鄰二氮菲水溶液、2 mL 0.15 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)和0.5 mL蒸餾水，混勻。然后加入新鮮配制的0.75 mmol·L-1的FeSO4溶液1 mL，混勻，再加入0.01%的過氧化氫1 mL，37 ℃水浴保溫60 min后，在536 nm測(cè)吸光值(D0)。樣品管加樣順序同上所述，僅以0.5 mL供試液替代損傷管中的蒸餾水，在536 nm處測(cè)吸光值(D1)。未損傷管加樣順序同樣品管，但以1 mL蒸餾水代替損傷管中0.01%過氧化氫，于536 nm處測(cè)吸光值(D2)。以槲皮素為陽性對(duì)照。計(jì)算自由基清除率(ROH)及自由基半數(shù)清除率(SC50)。
ROH=100(D1—D0)/(D2—D0)。
1.2.2 清除DPPH自由基
參照文獻(xiàn)[23]方法，在5 mL具塞試管中加入供試液1 mL，再加入3 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH溶液，搖勻，避光放置30 min，在517 nm處測(cè)吸光值Dy。空白對(duì)照組加樣順序同上，僅以1 mL無水乙醇替代供試液，測(cè)吸光值為Ds，供試液組加樣順序同上，僅以3 mL無水乙醇溶液替代DPPH溶液，測(cè)吸光值為DT，計(jì)算DPPH自由基清除率(RDPPH)及SC50。
RDPPH=100[1—(Dy—DT)/Ds]。
1.2.3 細(xì)胞試驗(yàn)
用MTT法檢測(cè)不同濃度槲皮素及其酯類化合物對(duì)EC109細(xì)胞、MGC-803細(xì)胞、EC9706細(xì)胞、PC-3細(xì)胞增殖的抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，試驗(yàn)組加入RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的槲皮素酯類衍生物至終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μg·mL-1，溶劑對(duì)照組中加入培養(yǎng)基，每孔終體積為200 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。72 h后，取出培養(yǎng)板于倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照。每孔再加入20 μL 5 mg·mL-1MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去原培養(yǎng)液后，用PBS清洗每孔，每孔各加入150 μL DMSO，晃勻使沉淀溶解，室溫下靜置約20 min(溶液呈紫紅色)，將96孔板置于酶標(biāo)儀上在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔光密度值，計(jì)算各組的生長(zhǎng)抑制率及半抑制濃度(IC50)。
1.3 化合物合成
1.3.1 中間體1(7,3′,4′-氧-三芐基槲皮素)的合成
按文獻(xiàn)[24]的方法，有所改進(jìn)。取蘆丁2.44 g(4.0 mmol)溶于20 mL 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1.93 g(14.0 mmol)無水碳酸鉀和催化劑碘化鉀攪拌，冰浴條件下，緩慢滴加1.6 mL(14.0 mmol)新蒸餾的氯化芐，緩慢升溫至室溫，攪拌過夜(約12 h)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。待反應(yīng)完全，加入冰醋酸將反應(yīng)液調(diào)至pH值6，再向其中加入200 mL蒸餾水，有大量沉淀析出，繼續(xù)攪拌1 h后，沉淀聚集于瓶底，棄去上清液。向沉淀中加入60 mL 95%乙醇，水浴加熱至固體完全溶解，一次性加入10 mL濃鹽酸，加熱回流，15 min后開始有黃色沉淀產(chǎn)生，1 h后反應(yīng)結(jié)束。冷卻，冰箱放置過夜，過濾，烘干，得粗品，用三氯甲烷/甲醇重結(jié)晶，干燥，得到黃色固體，產(chǎn)率78%。熔點(diǎn)(M.p)：188.3～190.1 ℃(文獻(xiàn)值188～190 ℃[24])。1H核磁共振(1H NMR)(400 MHz, DMSO)δ 12.42 (s, 1H, 5-OH)，9.72 (s, 1H, 3-OH)，7.90 (s, 1H, 2′-H)，7.85 (d,J=8.7 Hz, 1H, 6′-H)，7.32～7.40 (m, 15H, 3×OCH2C6H5)，7.25 (d,J=8.7 Hz, 1H, 5′-H)，6.67 (d,J=2.1 Hz, 1H, 8-H)，6.26 (d,J=2.1 Hz, 1H, 6-H)，5.21 (s, 4H, 2×OCH2C6H5)，5.11 (s, 2H, OCH2C6H5)。紅外光譜(IR)(KBr)：3 290、1 651、1 616、1 593、1 504、1 455、1 306、1 258、997、749 cm-1。
1.3.2 槲皮素酯類衍生物(3)的合成
槲皮素-3-氧-乙酸酯(3a)的制備。取7,3′,4′-氧-三芐基槲皮素-3-氧-乙酸酯0.614 g(2.0 mmol)溶于二氯甲烷/甲醇混合溶劑中，加入Pd/C(濃度為10%)催化劑0.159 g，室溫0.4 MPa壓力條件下，加氫反應(yīng)6 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾除Pd/C，濾液減壓蒸餾回收溶劑，得到固體，以氯仿-甲醇(體積比20∶1)為洗脫劑，過硅膠柱，得到淡黃色固體，產(chǎn)率60.0%。M.p：196.6～198.2 ℃。電噴霧-質(zhì)譜(ESI-MS)：343 [M-H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.23 (s, 1H, 5-OH)，10.78 (s, 1H, 7-OH)，9.77 (s, 2H, 3′-OH, 4′-OH)，7.35 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.29 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.93 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.48 (d,J=1.9 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=1.9 Hz, 1H, 6-H)，2.35 (s, 3H, CH3CO)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.37，168.49，165.12，161.52，157.05，156.33，149.78，145.95，130.05，120.98，120.06，116.49，115.39，103.89，99.53，94.54，20.78。IR(KBr)：3 327、1 753、1 651、1 602、1 567、1 489、1 357、1 306、1 183、939、793 cm-1。
槲皮素-3-氧-丙酸酯(3b)的制備。制備方法同3a。3b為黃色固體，產(chǎn)率46.0%。M.p：193.7～195.4 ℃。ESI-MS：357.0 [M-H]+，381.1 [M+Na]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.22 (s, 1H, 5-OH)，11.04 (s, 1H, 7-OH)，9.96 (s, 1H, 3′-OH)，9.65 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.28 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.92 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5-H)，6.48 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，2.68 (q,J=7.5 Hz, 2H, CH2COO)，1.15 (t,J=7.5 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 175.78，172.06，164.84，161.58，157.19，156.88，148.95，145.18，129.98，120.81，120.58，115.12，114.77，103.84，98.81，93.73，26.68，7.85。IR(KBr)：3 476、3 127、1 756、1 654、1 604、1 513、1 454、1 367、1 286、1 194、1 086、792 cm-1。
槲皮素-3-氧-丁酸酯(3c)的制備。制備方法同3a。3c為黃色固體，產(chǎn)率62%。M.p：206.6～208.5 ℃。ESI-MS：373.1 [M+H]+，395.1 [M+Na]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.24 (s, 1H, 5-OH)，11.02 (s, 1H, 7-OH)，9.91 (s, 1H, 3′-OH)，9.55 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=1.3 Hz, 1H, 2′-H)，7.27 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.48 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，2.63 (t,J=7.2 Hz, 2H, CH2COO)，1.66 (dd,J=14.6, 7.3 Hz, 2H, CH2CH2COO)，0.95 (t,J=7.4 Hz, 3H, CH3CH2CH2COO)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，170.91，165.07，161.55，157.06，156.46，149.72，145.93，130.03，120.98，120.09，116.39，115.48，103.92，99.51，94.53，35.41，18.33，13.77。IR(KBr)：3 372、3 073、2 968、2 878、1 750、1 735、1 597、1 533、1 449、1 377、1 295、1 197、993、846、603 cm-1。
槲皮素-3-氧-戊酸酯(3d)的制備。制備方法同3a。3d為黃色固體，產(chǎn)率62.5%。M.p：209.6～211.5 ℃。ESI-MS：385.0 [M-H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.23 (s, 1H, 5-OH)，11.03 (s, 1H, 7-OH)，9.91 (s, 1H. 3′-OH)，9.54 (s, 1H, 4′-OH)，7.32 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.48 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，2.64 (t,J=7.3 Hz, 2H, CH2COO)，1.68～1.56 (m, 2H, CH2CH2COO)，1.35 (dd,J=15.0, 7.5 Hz, 2H, CH2CH2CH2COO)，0.89 (t,J=7.3 Hz, 3H, CH3CH2CH2CH2COO)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，171.02，165.07，161.54，157.06，156.48，149.72，145.93，130.03，120.98，120.07，116.37，115.48，103.92，99.51，94.53，33.28，26.85，21.93，14.04。IR(KBr)：3 416、3 301、2 961、2 864、1 748、1 659、1 614、1 513、1 444、1 358、1 239、1 196、1 002、850、594 cm-1。
槲皮素-3-氧-庚酸酯(3e)的制備。制備方法同3a。3e為黃色固體，產(chǎn)率67.1%。M.p：195.9～197.1 ℃。ESI-MS：413.2 [M-H]+，437.1 [M+Na]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.24 (s, 1H, 5-OH)，10.98 (s, 1H, 7-OH)，9.90 (s, 1H, 3′-OH)，9.56 (s, 1H, 4′-OH)，7.32 (d,J=2.1 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.1 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.47 (d,J=1.9 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=1.9 Hz, 1H, 6-H)，2.63 (t,J=7.3 Hz, 2H, CH2COO)，1.70～1.56 (m, 2H, CH2CH2COO)，1.36～1.17 [m, 6H, (CH2)3],0.85 (t,J=6.6 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，171.02，165.07，161.55，157.05，156.48，149.73，145.93，130.03，120.98，120.06，116.33，115.48，103.92，99.50，94.52，33.57，31.33，28.43，24.74，22.42，14.33。IR(KBr)：3 304、2 930、2 857、1 745、1 658、1 612、1 513、1 443、1 357、1 275、1 196、1 002、850 cm-1。
槲皮素-3-氧-壬酸酯(3f)的制備。制備方法同3a。3f為黃色固體，產(chǎn)率60%。M.p：197.3～198.7 ℃。ESI-MS：441 [M-H]+，443 [M+H]+;1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.25 (s, 1H, 5-OH)，10.95 (s, 1H, 7-OH)，9.96 (s, 1H, 3′-OH)，9.61 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.47 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，2.63 (t,J=7.3 Hz, 2H, CH2COO)，1.70～1.56 (m, 2H, CH2CH2COO)，1.27 (dd,J=20.9, 9.8 Hz, 10H, (CH2)5)，0.84 (t,J=6.8 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，171.00，165.08，161.56，157.05，156.45，149.74，145.93，130.04，120.97，120.06，116.33，115.46，103.91，99.50，94.51，33.57，31.67，29.08，29.02，28.76，24.78，22.55，14.42。IR(KBr)：3 415、3 302、2 926、2 855、1 746、1 659、1 614、1 513、1 444、1 359、1 240、1 196、1 002、851、668 cm-1。
槲皮素-3-氧-硬脂酸酯(3g)的制備。制備方法同3a。3g為黃色固體，產(chǎn)率56.9%。M.p：208.3～210.6 ℃。ESI-MS：600 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.24 (s, 1H, 5-OH)，10.98 (s, 1H, 7-OH)，9.83 (s, 1H, 3′-OH)，9.52 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=2.1 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.1 Hz, 1H, 6′-H)，6.90 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.47 (d,J=1.8 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=1.8 Hz, 1H, 6-H)，2.62 (t,J=7.2 Hz, 2H, CH2COO)，1.62 (d,J=7.4 Hz, 2H, CH2CH2COO)，1.49～1.09 (m, 28H, 14×CH2)，0.83 (t,J=6.7 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，170.93，165.08，161.60，157.05，156.42，149.74，145.95，130.08，120.93，120.10，116.32，115.47，103.93，99.49，94.48，33.60，31.77，29.54，29.50，29.41，29.32，29.20，24.78，22.56，14.36。IR(KBr)：3 395、2 981、2 904、1 719、1 682、1 606、1 527、1 440、1 367、1 288、1 182、846、771、700 cm-1。
2 結(jié)果與分析
2.1 反應(yīng)路線設(shè)計(jì)
相關(guān)研究[25]表明，蘆丁溶于DMF，在加熱條件下與氯化芐反應(yīng)3 h，薄層層析(TLC)顯示有多個(gè)斑點(diǎn)，且后處理過程中產(chǎn)生很多褐色的黏稠狀固體。這可能是多元酚在堿性環(huán)境中加熱，發(fā)生了氧化或者聚合的副反應(yīng)。雖然經(jīng)過相關(guān)分離手段也得到了7,3′,4′-氧-三芐基槲皮素，但產(chǎn)率較低。在文獻(xiàn)[26]的基礎(chǔ)上，改進(jìn)試驗(yàn)條件：在室溫下，將蘆丁溶于DMF，加入3.5倍蘆丁質(zhì)量的氯化芐，攪拌反應(yīng)過夜。一方面，可以避免原料自身的聚合反應(yīng)；另一方面，低溫不易破壞5-羥基與4-羰基形成的氫鍵，使得最終產(chǎn)物以三保護(hù)為主，存在少部分二保護(hù)產(chǎn)物。通過氯仿/甲醇重結(jié)晶，得到較純的中間體7, 3′, 4′-氧-三芐基槲皮素。加入羧酸酯化得到圖2中2a～2g，催化氫解脫保護(hù)基得到目標(biāo)產(chǎn)物(圖2中3a～3g)。
2.2 對(duì)羥基自由基的清除能力
從表1可知，除化合物3f和3g外，其余化合物在試驗(yàn)濃度下，對(duì)羥基自由基的清除率均能達(dá)到70%以上，且清除率隨濃度增大呈明顯上升趨勢(shì)。從半數(shù)清除率(SC50)來看，化合物3a和3b的SC50均小于282.5 μmol·L-1，低于母藥槲皮素。并且發(fā)現(xiàn)槲皮素3位以4個(gè)碳以下的短鏈脂肪酸取代，將有利于其活性增強(qiáng)。通過比較化合物3a～3g，發(fā)現(xiàn)隨著脂肪烴碳鏈的延長(zhǎng)，其清除羥基自由基的活性大體呈現(xiàn)出越來越差的趨勢(shì)。
2.3 對(duì)DPPH自由基的清除能力
從表2可知，新合成的7個(gè)槲皮素酯類化合物除3g外，對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除效果，并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。其中，3a、3b、3c的SC50均小于槲皮素的18.8 μmol·L-1。這表明以4個(gè)碳以下的脂肪酸取代槲皮素3位羥基，有利于增強(qiáng)其清除DPPH自由基的能力。
(1)DMF為溶劑，加入碳酸鉀，攪拌下滴加氯化芐；(2)乙醇為溶劑，滴加濃鹽酸；(3)二氯甲烷為溶劑，加入二環(huán)己基碳二亞胺和DMAP；(4)甲醇二氯甲烷溶液(V∶V 1∶1)為溶劑，10%Pd/C為催化劑，催化加氫圖2 槲皮素酯類衍生物的合成路線
化合物取代基團(tuán)不同濃度下對(duì)羥基自由基的清除率/%20mg·L-150mg·L-1100mg·L-1200mg·L-1300mg·L-1SC50/(μmol·L-1)3aCH3CO—11.831.458.677.992.6265.23bCH3CH2CO—15.436.755.382.495.8266.23cCH3CH2CH2CO—5.019.943.381.990.1297.33dCH3(CH2)2CH2CO—1.26.730.156.988.0398.33eCH3(CH2)4CH2CO—5.617.226.666.577.3389.53fCH3(CH2)6CH2CO—6.614.633.547.265.9461.03gCH3(CH2)15CH2CO—1.75.320.342.143.1554.1槲皮素H15.733.865.085.896.3282.5
表2 不同濃度的槲皮素-3-氧-?；ヮ惢衔飳?duì)DPPH自由基的清除率效果
槲皮素的抗氧化活性以B環(huán)上的鄰二酚羥基活性最高。這是因?yàn)楫?dāng)B環(huán)羥基與自由基作用后，產(chǎn)生的自由基可以借助形成分子內(nèi)氫鍵得以穩(wěn)定，而且還可以通過共振形成苯醌，從而降低內(nèi)能，提高穩(wěn)定性。槲皮素酯類衍生物具有清除自由基活性的作用：一方面，歸因于槲皮素所具有的大π鍵共軛體系；另一方面，由于對(duì)槲皮素3位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，保留了槲皮素B環(huán)具有活性的兒茶酚結(jié)構(gòu)，引入的之類取代基，能擴(kuò)大整個(gè)分子的共軛體系，從而穩(wěn)定與自由基反應(yīng)后生成的中間體，因而抗氧化能力得到改善。
2.4 抗腫瘤活性
從表3可知，槲皮素對(duì)EC109和EC9706細(xì)胞的抑制作用相對(duì)較好，而對(duì)其他2種細(xì)胞的IC50值均大于128 μg·mL-1。合成的7種槲皮素酯類衍生物對(duì)這4種癌細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，但總體來看，普遍對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803有較好的抑制作用。構(gòu)效關(guān)系分析表明，槲皮素3位以脂肪鏈取代時(shí)，隨著碳鏈延長(zhǎng)，其對(duì)EC109細(xì)胞的抑制效果增強(qiáng)(圖3)。
雖然新合成的7個(gè)槲皮素酯類化合物對(duì)于人食管癌細(xì)胞EC109的作用均弱于槲皮素，但是普遍對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803表現(xiàn)出較好的抑制作用(表3)。其中化合物3f的IC50可以達(dá)到8.24 μg·mL-1?；衔?b對(duì)人前列腺癌細(xì)胞PC-3的抑制效果最好，IC50達(dá)到6.94 μg·mL-1，明顯優(yōu)于母核槲皮素。槲皮素3位以大于7個(gè)碳原子長(zhǎng)度的脂肪酸取代，有助于提高對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803的抑制作用。
表3 槲皮素-3-氧-酰基酯類化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率
圖3 槲皮素3位取代碳鏈長(zhǎng)短與對(duì)EC109細(xì)胞抑制作用的關(guān)系
3 小結(jié)
以廉價(jià)的蘆丁為原料，利用Williamson反應(yīng)保護(hù)槲皮素7,3′,4′位羥基，經(jīng)酸水解、Steglich酯化、催化加氫脫芐基，合成了7個(gè)槲皮素酯類衍生物，所有化合物均經(jīng)過紅外、核磁、質(zhì)譜確證。與現(xiàn)有的其他路線相比較，該路線具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、適于規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。初步構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素3位以4個(gè)碳以下的短鏈脂肪酸取代有利于增強(qiáng)其抗氧化活性，而以長(zhǎng)鏈脂肪酸取代有利于改善其抗腫瘤活性。采用MTT法評(píng)價(jià)了槲皮素及其7種衍生物對(duì)4種癌細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明，3e和3f對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803的IC50值分別達(dá)9.35和8.24 μg·mL-1，遠(yuǎn)小于槲皮素，有望進(jìn)一步研究成為抗胃癌的候選藥物。
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