● 朱小芳 謝一輝 馬亞娟 白文婷 平欲暉 黃麗萍

寬筋藤為防已科植物中華青牛膽Tinosporasinensis(Lour.)Merr.的干燥莖藤，藏藥名為勒哲，又名大接筋藤、松根藤、舒筋藤、牛掙藤、大松身，廣泛分布于廣西、廣東、西藏、云南、海南等地區(qū)[1-2]，其味微苦，性寒，歸肝經(jīng)，主要有舒筋通絡(luò)，祛風(fēng)止痛之功能，用于腰肌勞損，風(fēng)濕痹痛，跌打損傷等[3]。該屬植物的塊根、藤莖常作為中藥入藥。近年來(lái)，在藏藥質(zhì)量管理中出現(xiàn)的多種問題，如基原不統(tǒng)一或不清楚[4]，藥用部位不清楚，藥名混亂，同名異源或應(yīng)用混亂[5]等。目前藏藥寬筋藤在質(zhì)量控制上還沒有一種系統(tǒng)性的監(jiān)測(cè)方法，為此本文試圖建立其HPLC指紋圖譜，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent有限公司)，Sartoris BS214-D型電子天平(德國(guó)賽托利斯儀器有限公司)，Milli-Q超純水儀(江西鼎技科學(xué)儀器有限公司)，B-260恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-III循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)，KQ-50E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，AE-240型十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒公司)，F(xiàn)Z102微型植物粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2試劑甲醇，乙腈，甲酸均為色譜級(jí)(美國(guó)ACS公司)，水為Milli-Q超純水儀制備，其他試劑均為分析純。

1.3試藥丁香苷、Tinoscorside D、3，4-二甲氧基苯基-O-β-D-呋喃芹糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品，為本實(shí)驗(yàn)室分離得到，通過(guò)碳?xì)渥V和質(zhì)譜數(shù)據(jù)等確定它們的結(jié)構(gòu)，純度經(jīng)HPLC面積歸一化法檢測(cè)大于98%。

1.4樣品本實(shí)驗(yàn)藥材由西藏醫(yī)學(xué)院格桑次仁副教授采購(gòu)，共8批寬筋藤樣品，經(jīng)西藏醫(yī)學(xué)院格桑B次仁副教授鑒定為防己科植物青牛膽屬中華青牛膽Tinosporasinensis(Lour.)Merr.的藤莖。見表1。

表1 藥材來(lái)源

續(xù)表1

樣品采集地點(diǎn)采集時(shí)間S6藏醫(yī)學(xué)院藏藥廠2016.04S7西藏2015.05S8新疆烏魯木齊2016.08

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Spursil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫(0-15min3%A;15-40min，3%-13%A;40-60min，13%-13%A;60-68min，13%-18%A;68-83min，18%-18%A;83-90min，18%-20%)，檢測(cè)波長(zhǎng)為272nm，柱溫25℃，流速為1ml/min，進(jìn)樣量為10μL。

2.2對(duì)照品溶液的制備取丁香苷、Tinoscorside D、3，4-dimethoxyphenyl-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside的對(duì)照品約2.0mg，精密稱定，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解定容。即得對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備取寬筋藤粉末2.0g(過(guò)二號(hào)篩)，精密稱定，加入60%甲醇20ml，回流提取3次，每次20min，合并濾液，回收試劑濃縮至干，用甲醇溶液超聲溶解并定容至10ml，過(guò)0.22μm膜，即得到供試品溶液。

2.4方法學(xué)考察為了分析方法的可行性，以西藏拉薩市場(chǎng)采集的寬筋藤藥材為研究對(duì)象，對(duì)其精密度，穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性進(jìn)行相應(yīng)考察，選擇保留時(shí)間為40.7min左右的色譜峰為參照峰，計(jì)算HPLC色譜圖中色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取寬筋藤藥材，按2.3方法制備同一供試品溶液，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，考察儀器的精密度，測(cè)得相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，所用儀器的精密度良好。結(jié)果見表2和表3。

表2 相對(duì)保留時(shí)間精密度實(shí)驗(yàn)

表3 相對(duì)峰面積精密度實(shí)驗(yàn)

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取寬筋藤藥材，按2.3法制備同一供試品溶液，依照2.1色譜條件，分別在0h，2h，4h，8h，16h，24h測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)得相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示(見表4和表5)相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表5 相對(duì)峰面積穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取寬筋藤藥材2.0g，精密稱定，共6份，按2.3法制備同一供試品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示(見表6和表7)，樣品制備方法重復(fù)性好，符合指紋圖譜的要求測(cè)得相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%。

表6 相對(duì)保留時(shí)間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

表7 相對(duì)峰面積重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.5藏藥寬筋藤藥材指紋圖譜分析

2.5.1 藏藥寬筋藤藥材指紋圖譜的采集 取不同產(chǎn)地，不同采收時(shí)間的寬筋藤藥材，按2.3法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)樣分析。根據(jù)色譜圖，并對(duì)其色譜圖進(jìn)行積分，同時(shí)標(biāo)定14個(gè)共有峰。所選擇的共有峰可以較全面的體現(xiàn)出寬筋藤中極性部位化學(xué)成分的信息。通過(guò)安捷倫化學(xué)工作站輸出不同產(chǎn)地藥材的HPLC色譜圖。

2.5.2 藏藥寬筋藤藥材的指紋圖譜相似度分析 根據(jù)國(guó)家藥典委員會(huì)制定的《中國(guó)色譜指紋圖譜相似度評(píng)估系統(tǒng)》(2010版)對(duì)不同產(chǎn)地，不同采收時(shí)間的寬筋藤藥材指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，寬筋藤藥材指紋圖譜的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了自動(dòng)匹配，標(biāo)定了14個(gè)共有峰，同時(shí)給出了對(duì)照指紋圖譜圖1，將各樣品和對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較，計(jì)算各產(chǎn)地寬筋藤藥材提取物指紋圖譜的相似度。不同產(chǎn)地指紋圖譜見圖2，指紋圖譜相似度結(jié)果見表8。

圖1 寬筋藤對(duì)照指紋圖譜

圖2 不同產(chǎn)地寬筋藤高效液相指紋圖譜

S1S2S3S4S5S6S7S8對(duì)照指紋圖譜S110.860.7810.750.8790.880.8510.8140.896S20.8610.9530.8070.9130.9540.9570.9170.98S30.7810.95310.6270.8020.9630.9740.8250.905S40.750.8070.62710.8870.6720.6610.9260.885S50.8790.9130.8020.88710.8490.8520.9140.957S60.880.9540.9630.6720.84910.9760.8410.932S70.8510.9570.9740.6610.8520.97610.8370.929S80.8140.9170.8250.9260.9140.8410.83710.965對(duì)照指紋圖譜0.8960.980.9050.8850.9570.9320.9290.9651

2.5.3 指紋圖譜中色譜峰的化學(xué)指認(rèn) 用化學(xué)結(jié)構(gòu)已被鑒定的部分化合物做對(duì)照，對(duì)照指紋圖譜中部分共有指紋峰進(jìn)行確認(rèn)，通過(guò)保留時(shí)間和圖譜，確認(rèn)8號(hào)峰為3，4-二甲氧基苯基-O-β-D-呋喃芹糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，9號(hào)峰為丁香苷，10號(hào)峰為Tinoscorside D。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑種類與方式、體積分?jǐn)?shù)、料液比、時(shí)間均進(jìn)行了考察，對(duì)比了甲醇、乙醇，超聲、回流兩種方式所得供試品溶液的指紋圖譜，結(jié)果表明：甲醇回流>乙醇回流>甲醇超聲>乙醇超聲，故選擇甲醇回流法進(jìn)行提取。比較了體積分?jǐn)?shù)40%，60%，80%，100%甲醇所提取的供試品溶液圖譜，結(jié)果表明甲醇濃度為40%和100%濃度提取出的色譜峰少，而且峰面積偏低；甲醇濃度為60%和80%時(shí)，色譜峰數(shù)量以及峰面積相差不大，故從色譜峰數(shù)量，峰面積以及溶劑成本多方面考慮，選擇60%甲醇溶液為提取溶劑。分別考察了料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25后的供試品溶液圖譜，發(fā)現(xiàn)不同的料液比對(duì)于寬筋藤提取液的影響甚小，從節(jié)約成本等方面考慮，本實(shí)驗(yàn)的料液比選擇1∶10。分別考察了回流提取20min，40min，60min后的供試品溶液圖譜，結(jié)果表明：從峰數(shù)量上看，不同提取時(shí)間所得到峰數(shù)量幾乎相同；從峰面積和峰型上看，提取20min最佳。故本實(shí)驗(yàn)選擇提取時(shí)間為20min。

用乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫條件的考察，反復(fù)調(diào)整流動(dòng)相比例后，確定洗脫比例，采用DAD檢測(cè)器在190-400nm處進(jìn)行紫外吸收全波段掃描，并獲取不同波長(zhǎng)下的數(shù)據(jù)(210，254，272nm，280，323，365nm)，對(duì)于指紋圖譜的確認(rèn)必須遵循信息量最大化的原則，結(jié)果顯示，272nm下色譜峰的數(shù)量較多且分離度較好。故選擇272nm下作為指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明8批寬筋藤藥材的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%。通過(guò)《中國(guó)色譜指紋圖譜相似度評(píng)估系統(tǒng)》(2010版)計(jì)算出8批藥材的相似度均大于0.8，符合指紋圖譜的分析要求。表明HPLC指紋圖譜方法可作為藏藥寬筋藤質(zhì)量控制的檢測(cè)方法。一方面通過(guò)比較圖譜，可以直觀看出各共有峰的比例變化，來(lái)判斷產(chǎn)品質(zhì)量的變；另一方面也可以通過(guò)測(cè)定各峰峰面積對(duì)活性指標(biāo)成分進(jìn)行定量。本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC指紋圖譜可以有效分析和監(jiān)測(cè)其質(zhì)量。

[1]全國(guó)中草藥匯編編寫組.全國(guó)中草藥匯編[M].上冊(cè).北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：652.

[2]廣東中藥志編輯委員會(huì)．廣東中藥志[M]．廣州：廣東科技出版社，1994：501-502．

[3]廣東省食品藥品監(jiān)督管理局.廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(第一冊(cè))[S].廣州：廣東科技出版社，2004：183.

[4]鐘國(guó)躍，周福成，石上梅，等.藏藥材常用品種及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀調(diào)查分析研究[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37(16)：2349-2355.

[5]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：藏藥卷[M].s上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002.