李曉霞，王迪，王桂臻，劉磊，李震宇，秦雪梅，李科*

（1.山西省果業(yè)工作總站，山西 太原 030001；2.山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；3.山西大學化學化工學院，山西 太原 030006）

黃芪，作為我國傳統(tǒng)的珍貴補益藥材之一，使用歷史已有2000多年，素有 “十方八芪”之說。中華人民共和國藥典（2010版）規(guī)定，黃芪為豆科草本植物黃芪屬蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪 A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根［1］。本品具有補氣固表、利尿排毒、斂瘡生肌等功效［2］，用于氣虛乏力，食少便溏［3］，是一種常見的補益中藥。黃芪的主要化學成分包括黃酮類、皂苷類、黃芪多糖、氨基酸等多種成分［4］。其中，黃芪多糖具有增強機體抵抗力、促進抗體生成、促進免疫、雙向調(diào)節(jié)血糖和保護心血管系統(tǒng)等作用［5-8］，是黃芪發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的主要物質(zhì)。然而復方中藥中黃芪多糖主要經(jīng)口服進入胃內(nèi)，在胃酸與胃酶作用下降解為寡糖片段后被吸收利用。這些寡糖化合物分子量分布如何，不同種質(zhì)資源蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）多糖經(jīng)胃酸處理后是否存在差異，這些寡糖如何發(fā)揮活性作用目前尚不清楚。

近年來關(guān)于體外模擬人工胃液實驗研究較多，如金暉［9］等通過南瓜多糖在體外模擬人工胃液條件下的水解實驗獲知，隨胃酸與胃酶作用時間的延長，還原糖的量不斷緩慢增加，HPLC結(jié)果顯示作用30 min時出現(xiàn)小分子糖，作用90 min時大分子量多糖出現(xiàn)明顯變化，提示南瓜多糖在體外模擬人工胃液環(huán)境中隨時間作用會發(fā)生一定程度的降解，產(chǎn)生還原糖和寡糖片段。陳萍［10］等通過抗氧化活性較好的茶多糖TPF70在體外模擬人工胃液條件下的水解試驗獲知，茶多糖在體外模擬人工胃液環(huán)境中隨時間作用會發(fā)生一定程度的降解，產(chǎn)生還原糖和寡糖片段。

因此，本研究模擬人工胃酸條件處理不同種質(zhì)資源蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）細胞可溶性多糖及糖綴合物，獲得指紋圖譜，分析其降解片段的分子量分布，并用主成分分析找出不同種質(zhì)資源黃芪差異的糖組分。研究結(jié)果不僅為黃芪種質(zhì)資源鑒別提供了方法，而且為降解產(chǎn)生的黃芪活性寡糖篩選奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實驗所需植物材料包括蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）兩個種，共24批。購買自河北安國藥材市場。將藥材保存于陰涼、干燥通風處。藥材詳細信息如表1所示。將這24批不同種質(zhì)資源的黃芪藥材分別粉碎得到細粉，備用。

表1 黃芪樣本信息

1.2 儀器與試劑

DYY-10C型電泳儀電源，DY-C7型電泳儀（北京市六一儀器廠）；真空冷凍干燥儀（ZD-A1L）；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A；高速冷凍離心機（寧波新芝科技有限公司TGL-16型）。

葡萄糖、麥芽糖、棉子糖、麥芽四聚糖、麥芽五聚糖和麥芽六聚糖標準品；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、8-氨基萘-1，3，6-三磺酸（ANTS）、NaCNBH3、丙烯酰胺（Acrylamide）、N，N-亞甲基二丙烯酰胺（Bisacrylamide）、尿素（Urea）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸（H3BO3）、過硫酸銨（AP）、乙醇等均為分析純；人工胃酸。

1.3 方法

1.3.1 黃芪多糖的提取和純化

（1）提取粗多糖將干燥的蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）粉碎成粉末，過100目篩，取黃芪細粉約5 g，精密稱定后置于1000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL（1∶100），100℃回流提取1 h，降至室溫后離心取上清液。殘渣再加水400mL（料液比1∶80），重復提取1次，取上清，合并上清。濃縮，用95%的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80%。3000 r·min-1離心10min。合并沉淀，冷凍干燥的多糖粗粉。

（2）純化多糖 將上一步驟得到的多糖粗粉溶于水中，加入各10%體積的10.6%的亞鐵氰化鉀溶液和21.9%的乙酸鋅溶液，振搖后靜置30 min，離心得到純化多糖，凍干，備用。

1.3.2 人工胃液的配制 參照2010年版 《中國藥典》規(guī)定，取稀鹽酸16.4 mL，加約800 mL水及胃蛋白酶10 g，搖勻后加水稀釋成1000 mL，即得。

1.3.3 黃芪多糖的酸解和衍生化 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）多糖約5 mg，置于10 mL具塞玻璃管中，分別用人工胃酸2 mL對四種多糖進行酸解，然后根據(jù)最優(yōu)降解條件，40℃搖床孵育1 h，置于80℃水浴上滅活20 min，離心（3000 r·min-1，5 min），去上清，氮氣吹干。將酸解產(chǎn)物溶于200μL的NaCNBH3溶液中，加入200μL的ANTS衍生化試劑，37℃搖床孵育15 h后，將產(chǎn)物用氮氣吹干，溶于1 mL的6 mol·L-1的尿素溶液，備用。

1.3.4 黃芪多糖和糖標準品酸解產(chǎn)物電泳分析 采用垂直板凝膠電泳分離糖標準品及黃芪多糖部分酸解衍生化產(chǎn)物，分離膠和濃縮膠分別為0.1 moL·L-1Tris-H3BO3（pH＝8.2）溶液配制的30 g·（100 mL）-1和8 g·（100 mL）-1的聚丙烯酰胺凝膠。電泳緩沖液為0.1～0.2 moL·L-1Tris-H3BO3（pH＝8.2）。上樣量為1～3μL，以溴酚藍為前沿指示劑，首先采用80 V電壓進行電泳分離60 min，隨后采用200V電壓進行電泳分離120 min。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 將電泳圖導入Quantity One軟件，經(jīng)過扣除背景、手動校正、基線校準等處理后，得到色譜圖。色譜圖轉(zhuǎn)化為Excel數(shù)據(jù)后導入SMICA-P 13.0進行分析，然后運用代謝組學分析技術(shù)尋找差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）多糖酸解產(chǎn)物的電泳指紋圖譜

圖1 黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物的PACE指紋圖譜分析圖

2.2 黃芪多糖降解后黃芪寡糖的分子量分布分析

由黃芪多糖部分酸解衍生化產(chǎn)物電泳的Rf值，根據(jù)PACE電泳后六種糖標準品的Rf-分子量標準曲線（圖2），推出黃芪多糖降解后黃芪寡糖相應的分子量。分子量與Rf值分布如下圖2。

圖2 葡萄糖、麥芽糖、棉子糖、麥芽四聚糖、麥芽五聚糖和麥芽六聚糖標準品電泳后Rf-分子量標準曲線

2.3 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）四組多糖酸解產(chǎn)物的電泳指紋圖譜多元統(tǒng)計分析

圖3中A為蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）多糖酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜PCA得分散點圖，可見，蒙古芪與膜莢芪可得到較好分離，蒙古移栽芪和野生芪分離明顯，膜莢移栽芪和野生芪分離不明顯。進行有監(jiān)督的PLS-DA分析（見圖3-B）發(fā)現(xiàn)與PCA圖基本一致，模型參數(shù)為R2＝0.425，Q2＝-0.639。用外部模型驗證方法排列實驗來證明模型成立（見圖3-C），載荷圖分析（見圖3-D）可以繼續(xù)后面部分差異成分的篩選。

圖3 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜的多元統(tǒng)計分析

從A圖分析，蒙古黃芪和膜莢黃芪種屬之間的差異要大于移栽和野生生長方式間差異，野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪分離現(xiàn)象明顯，移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪分離現(xiàn)象明顯，可以對同一生長方式不同種屬黃芪進行差異性片段尋找；膜莢黃芪中移栽芪和野生芪分離現(xiàn)象不明顯，尋找差異性片段意義不大；蒙古黃芪中移栽芪和野生芪能得到很好的分離，對區(qū)分蒙古黃芪移栽和野生的差異性片段進行篩選。

2.4 篩選野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性生物標志物

圖4中A為野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪多糖酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜OPLS-DA散點圖，可見，野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪可得到較好分離。用外部模型驗證方法排列實驗來證明模型成立（見圖4-B），載荷圖分析（見圖4-C）可以進行差異成分的篩選。

由圖分析可知，三糖和四糖可以作為區(qū)分野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪的主要差異性片段。對該片段分析發(fā)現(xiàn)，野生膜莢黃芪中三糖和四糖的含量均高于野生蒙古黃芪的含量。

2.5 篩選移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性生物標志物

圖6中A為移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪多糖酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜OPLS-DA散點圖，可見，野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪可得到較好分離。用外部模型驗證方法排列實驗來證明模型成立（見圖6-B），載荷圖分析（見圖6-C）可以進行差異成分的篩選。

圖4 野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜的多元統(tǒng)計分析

圖5 野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性糖片段個數(shù)（A）和糖片段柱狀圖（B）

圖6 移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜的多元統(tǒng)計分析

由圖分析可知，五糖和六糖可以作為區(qū)分移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪的主要差異性片段。對該片段分析發(fā)現(xiàn)，移栽膜莢黃芪中五糖和六糖的含量均高于移栽蒙古黃芪的含量。

2.6 篩選蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性生物標志物

圖8，為了明確蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物間的化學差異成分，分組對酸解產(chǎn)物的電泳指紋圖譜進行OPLS-DA、模型驗證及載荷圖分析，篩選生物標志物。

蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜的OPLS-DA分析結(jié)果見圖8。圖8A顯示野生和移栽黃芪多糖酸水解產(chǎn)物得到很明顯的分離，其中野生芪位于散點圖的右部，而移栽芪位于散點圖的左部，表明它們之間存在較大的差異。圖8B模型驗證采用總解釋變量（R2值）和模型可預測性（Q2值）進行評估?；貧w線縱軸相交并處于零點以下，左端任何一次隨機排列產(chǎn)生的R2、Q2均小于右端，且最右端的兩個值差距較小。表明模型具有良好的可預測性和擬合度。模型驗證結(jié)果成立，模型可靠。通過相應的載荷圖中距原點較遠的點篩選具有潛在貢獻的生物標志物（VIP＞1）（圖8C）。

圖7 移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性糖片段個數(shù)（A）和糖片段柱狀圖（B）

圖8 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物電泳指紋圖譜的OPLS-DA散點圖（A），模型交叉驗證圖（B）及Loading圖（C）

圖9 蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖人工胃酸酸解產(chǎn)物差異性糖片段個數(shù)（A）和糖片段柱狀圖（B）

由圖分析可知，四糖和六糖可以作為區(qū)分蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）生長方式的主要差異性片段。對該片段分析發(fā)現(xiàn)，野生蒙古黃芪中四糖的含量高于移栽蒙古黃芪含量，移栽蒙古黃芪六糖的含量高于野生蒙古黃芪含量。

3 討論與結(jié)論

在本研究中，野生黃芪選自道地產(chǎn)區(qū)山西渾源等地，這些地方多是土質(zhì)疏松的半坡環(huán)境，夏季日照充足，干旱少雨，晝夜溫差大，冬季寒冷，野生黃芪在此環(huán)境中生長多達5年以上。移栽黃芪則是農(nóng)戶選擇肥沃土地，經(jīng)移栽施肥生長2年后采收。相比之下，野生黃芪受到了更多干旱、低溫、營養(yǎng)缺乏等環(huán)境脅迫，而移栽黃芪較少受到逆境的影響。大量研究表明，植物通常以細胞和整個生物有機體抵抗脅迫。逆境下，植物會在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、滲透調(diào)節(jié)、植物激素水平、膜保護物質(zhì)及活性氧平衡、逆境蛋白等諸多環(huán)節(jié)發(fā)生變化，涉及到植物水分、光合、呼吸、物質(zhì)代謝等多項生理過程［11-15］。已有研究報道，細胞質(zhì)中游離糖及糖醇成分是植物受到生長脅迫而誘導產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)在細胞中大量積累，調(diào)節(jié)細胞滲透壓，有利于植物保持水分，抵抗鹽堿、低溫等多種逆境，對維持植物的正常生理功能具有重要作用［11］。因此，在環(huán)境影響下，野生黃芪比移栽黃芪經(jīng)受更多的脅迫因素，野生黃芪中的多糖含量遠遠高于移栽黃芪［16］。雖然本研究找出了四糖和六糖可以作為區(qū)分蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）生長方式的主要差異性片段，然而多糖經(jīng)人工胃酸水解后的糖片段含量差異，活性如何，是否可以作為評價黃芪種質(zhì)資源的指標還有待進一步研究。

本實驗通過在體外模擬人工胃液條件測定人工胃酸對蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）黃芪多糖的酸解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)基于人工胃酸條件水解能很好的區(qū)分蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）。根據(jù)PACE電泳后六種糖標準品的Rf-分子量標準曲線（圖2），推出黃芪多糖降解后黃芪寡糖相應的分子量及其分布。分析結(jié)果顯示：膜莢黃芪中移栽芪和野生芪分離現(xiàn)象不明顯，尋找差異性片段意義不大，而蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）多糖酸解產(chǎn)物中的四糖和六糖可以作為區(qū)分生長方式的專屬性糖片段，且野生蒙古黃芪中四糖的含量高于移栽蒙古黃芪含量，移栽蒙古黃芪中六糖的含量高于野生蒙古黃芪含量；三糖和四糖可以作為區(qū)分野生蒙古黃芪與野生膜莢黃芪的主要差異性片段，對該片段分析發(fā)現(xiàn)，野生膜莢黃芪中三糖和四糖的含量均高于野生蒙古黃芪含量；五糖和六糖可以作為區(qū)分移栽蒙古黃芪與移栽膜莢黃芪的主要差異性片段，對該片段分析發(fā)現(xiàn)，移栽膜莢黃芪中五糖和六糖的含量均高于移栽蒙古黃芪含量。這一指標為蒙古黃芪（移栽芪和野生芪）和膜莢黃芪（移栽芪和野生芪）的鑒別提供了依據(jù)，同時也為黃芪藥材的品質(zhì)評價奠定了基礎(chǔ)。

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