劉 蕭，馬千里，楊仁黨*

（華南理工大學 制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東 廣州 510640）

果糖、葡萄糖和蔗糖等可溶性糖是食品的重要組成成分之一，為人體生長提供所需的能量，同時也是食品的重要風味成分[1]。此外，可溶性糖及有機酸是水果的重要營養(yǎng)成分和重要風味物質(zhì)，其構(gòu)成和含量水平是決定水果甜酸風味的關(guān)鍵因素[2-5]。在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的還原糖和可溶性糖是決定產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素，其含量的變化與功能性成分也有著密切的關(guān)系[6-8]。血液中的葡萄糖提供了人體組織細胞所需的大多能量，所以血糖含量必須保持在一定范圍內(nèi)才能維持含量體內(nèi)各器官和組織的需要。在醫(yī)藥方面，從天然產(chǎn)物和真菌中提取的活性多糖類具有抗癌、抗氧化、降血糖等活性[9-11]，低聚木糖、低聚果糖、甲殼低聚糖等低聚糖是功能保健產(chǎn)品的重要成分之一[12-13]。由于糖的分析涉及到食品、發(fā)酵、醫(yī)學、藥學等多個領(lǐng)域，所以糖含量測定技術(shù)一直是國內(nèi)外的研究熱點。糖測定的方法有多種，國內(nèi)食品檢測目前主要采用GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》[14]。除此之外比較常用的實驗室分析方法有3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法、苯酚-硫酸法、費林試劑法等[15-18]。近年來儀器分析如高效液相色譜法也被用于多種糖分的分析檢測[19-20]。實驗室方法使用試劑、儀器較多，操作繁瑣費時，并且可測定的糖濃度范圍有限；大型設備價格昂貴，整個過程需要專業(yè)人士熟練操作，對操作者有較高的要求。因此，手持糖度儀等小型測定儀器開始逐漸走向市場，其測定范圍較大，使用簡單，但是仍然沒有脫離儀器，維護、攜帶較為不方便。

試紙法是把化學反應從試管移到試紙上進行，利用產(chǎn)生明顯顏色的化學反應定性或定量檢測待測物質(zhì)。試紙法具有操作簡單、攜帶方便、價格便宜、無需儀器設備、結(jié)果顯示直觀、不需檢修維護等特點，具有良好的應用前景[21]。目前已應用于快速檢測食品中的過氧化氫、亞硝酸鹽、尿素、組胺、敵敵畏、硼砂等物質(zhì)[22-29]，但測定食品中糖含量的研究較少。

本實驗以DNS比色法為顯色機理，通過對顯色配方和工藝條件優(yōu)化，制備了還原糖快速檢測試紙。并將該方法與糖度儀測定結(jié)果進行對比，驗證其準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飲料、水果 市購；定性濾紙（φ 7 cm）、定量濾紙（φ 7 cm）、層析濾紙（φ 7 cm） 杭州沃華濾紙有限公司；DNS（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；氧化鈣（分析純） 天津市福晨化學試劑廠；葡萄糖（分析純） 上海博奧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS26型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9140A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；FA1104電子天平上海精天電子儀器廠；RHB80糖度計 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

在堿性條件下，還原糖與顯色劑DNS共熱反應生成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的含量與反應產(chǎn)物棕紅色顏色的深淺成正比關(guān)系。氧化鈣與待測樣品中的水反應，生成氫氧化鈣，為反應提供了堿性環(huán)境，同時放出熱量，具備了還原糖與DNS發(fā)生氧化還原反應的條件，生成了棕紅色的氨基化合物，實驗化學反應原理如圖1所示。通過與標準色階對比，確定還原糖的質(zhì)量濃度，實現(xiàn)了還原糖的半定量檢測。

圖1 DNS試劑顯色原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram for the principle of DNS colorimetry

1.3.2 葡萄糖溶液的配制

以葡萄糖溶液作為標準還原糖溶液，分別配制濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 mol/L的葡萄糖溶液。

1.3.3 試紙的制備

配制質(zhì)量濃度6.0 g/L的DNS溶液，取100 mL于培養(yǎng)皿中，將快速定性濾紙（φ 7 cm）浸泡在溶液中1 min，用鑷子取出置于鼓風干燥箱，在50 ℃條件下進行干燥。干燥結(jié)束后，將氧化鈣粉末均勻涂在基紙上下表面，覆涂量為0.1 g/面。將制備好的試紙統(tǒng)一裁剪成3 cm×1 cm規(guī)格的長條，儲存于避光、干燥、密閉處備用。

1.3.4 試紙制備條件及顯色劑配方的選擇

移取20 μL標準葡萄糖溶液滴加在試紙上，觀察并記錄標準葡萄糖溶液在試紙上的顯色效果、色階變化、顯色穩(wěn)定性、均勻性，從而確定最佳試紙制備條件以及顯色劑濃度。

1.3.5 標準比色卡的制備

在最優(yōu)條件下制備還原糖試紙，分別滴加20 μL 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 mol/L的標準葡萄糖溶液于試紙上，顯色5 min后用相機拍攝照片，采用計算機軟件Photoshop在顏色面板中讀取RGB值，然后制備試紙標準比色卡。

1.3.6 試紙的檢測范圍

在最優(yōu)條件下制備的試紙與系列標準葡萄糖溶液反應，確定試紙的檢測上下限。

1.3.7 樣品測定

利用制備的還原糖檢測試紙對未知濃度葡萄糖溶液、購自超市的飲料及水果進行檢測。同時采用手持糖度儀進行檢測對比，驗證試紙的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 試紙基紙的選擇

試紙在使用過程中，基紙對試紙的顯色有顯著的影響，試紙基紙的選擇需要滿足容易吸附試劑且吸附量較大、干燥時間短、顯色速度快、顏色變化明顯等要求[30]。制作試紙的基紙有多種，本實驗分別選用8 種類型基紙，觀察顯色效果，確定最佳基紙。

表1 基紙對試紙顯色效果的影響Table 1 Effect of base paper on color development

如表1所示，1號和2號基紙顯色程度一般，色階變化不明顯。5、6、7、8號基紙顯色均勻性較差，3號基紙顯色清晰，色階變化明顯，顯色均勻性較好。因此，本實驗采用3號基紙快速定性濾紙作為試紙的基紙。

2.2 顯色劑質(zhì)量濃度的確定

實驗采用DNS作為顯色劑，在其他制備條件相同條件下，考察不同質(zhì)量濃度顯色劑對試紙顯色性能的影響，結(jié)果見圖2。顯色劑質(zhì)量濃度不同，試紙顯色效果和顯色梯度也不同，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，顯色劑質(zhì)量濃度越高，試紙顯色越清晰，顯色梯度越明顯。顯色劑質(zhì)量濃度為6.0 g/L和8.0 g/L時，試紙顯色效果基本相同。考慮到試劑成本及能源節(jié)約問題，實驗選用的顯色劑DNS質(zhì)量濃度為6.0 g/L。

圖2 顯色劑質(zhì)量濃度對試紙的影響Fig. 2 Impact of different color reagent concentrations on the strip test

2.3 干燥溫度的選擇

選擇優(yōu)化后的條件，在不同溫度條件下干燥，考察干燥溫度對試紙顯色效果的影響，如表2所示。在不同溫度條件下干燥制得的試紙顯色效果差異不大，低溫干燥的試紙有底色的干擾，并且干燥所需的時間較長，隨著溫度升高，試紙干燥時間縮短，但試紙表面出現(xiàn)褶皺現(xiàn)象，綜合考慮到干燥時間等因素，本實驗選用50 ℃鼓風干燥制備試紙。

表2 干燥溫度對試紙效果的影響Table 2 Effect of drying temperature on the strip test

2.4 標準比色卡的制備

采用試紙比色模式，根據(jù)試紙的顏色變化制作標準比色卡，從而實現(xiàn)對還原糖的半定量快速檢測。制作的標準比色卡如圖3所示，隨著葡萄糖濃度的增加，試紙顏色也發(fā)生了明顯的變化，顏色變化梯度為淺黃色、淺棕色、深棕色（淺到深）。

圖3 試紙標準比色卡Fig. 3 Standard colorimetric card

2.5 試紙的檢測范圍

用試紙法分別檢測不同濃度梯度的葡萄糖溶液，結(jié)果表明，當葡萄糖溶液的濃度低于0.01 mol/L時，肉眼無法辨別試紙的顏色變化，葡萄糖濃度增加，試紙顯色加深，當葡萄糖溶液濃度達到3.00 mol/L時，試紙顯色為深棕色（最深）。因此，試紙的檢測范圍為0.01～3.00 mol/L。

2.6 樣品檢測結(jié)果

用本實驗制備的試紙檢測樣品中的還原糖濃度，同時與糖度計檢測結(jié)果進行對比，結(jié)果見表3，試紙法測定的濃度范圍與糖度計測定的結(jié)果是對應的，其準確性良好，驗證了本實驗制備的還原糖檢測試紙在實際檢測應用中的可行性。

表3 樣品糖含量檢測結(jié)果Table 3 Results of detection of reducing sugar in real samples

3 結(jié) 論

本實驗建立了一種快速檢測還原糖濃度的試紙法，對其制備工藝條件及配方進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，采用快速定性濾紙（φ 7 cm）、質(zhì)量濃度6.0 g/L的DNS、浸泡時間1 min、干燥溫度50 ℃、氧化鈣覆涂量0.1 g/面制備的試紙具有良好的性能。試紙法檢測所需時間僅需5 min，檢測范圍為0.01～3.00 mol/L，具有樣品量小、反應靈敏、成本低廉、使用方便、操作簡單的優(yōu)點。與傳統(tǒng)的還原糖實驗檢測方法相比，實現(xiàn)了現(xiàn)場快速檢測，其檢測范圍較大，應用領(lǐng)域廣泛，是一種快速半定量檢測方法，在食品、發(fā)酵、醫(yī)學、藥學等產(chǎn)業(yè)中有良好的發(fā)展前景。

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