陳思敏，羅彤暉，費永濤，吳健鋒，劉冬梅*

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

硝酸鹽和亞硝酸鹽主要通過蔬菜食用進入人體，亞硝酸鹽是一種有毒物質(zhì)，人食用后會在體內(nèi)產(chǎn)生致癌性的亞硝胺[1-2]，可導致胃癌、腸癌和肝癌等[3]，且大量攝入亞硝酸鹽可誘發(fā)高鐵血紅蛋白癥[4]，產(chǎn)生常見的亞硝酸鹽急性中毒癥狀[5]。因此嚴格控制食品中亞硝酸鹽含量非常重要。當前研究的反硝化細菌大多為致病微生物和土壤微生物，例如Geobacillus kaustophilus[6]、Bacillus megaterium[7]、Geobacillus thermodenitrificans[8]、Alcaligenes xylosoxidans[9]、Ralstonia pickettii[10-11]，它們能夠合成一種亞硝酸鹽還原酶（nitrite reductase，NiR），其具有較強的降解亞硝酸鹽的能力，但是這些細菌不能食用，無法應用在食品中。目前應用在食品中的反硝化細菌主要是乳桿菌[12-14]，已報道的有干酪乳桿菌鼠李糖亞種（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）6013[15]、植物乳桿菌（L. plantarum）[16-17]、短乳桿菌（L. brevis）[18]等。研究表明，大多數(shù)乳酸菌的NiR活性對于土壤中的反硝化細菌來說是比較低的。

本研究組在豆瓣醬中分離得到一株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），命名為LJ01，可應用于食品中，前期研究發(fā)現(xiàn)該菌株同樣可以合成具有高活性的NiR，而目前食品來源的芽孢桿菌中NiR的研究極少，且對于其中NiR的分離純化和性質(zhì)研究還鮮見科學的方法。本研究組在前期采用直接從B. cereus LJ01天然菌中分離純化的方式無法得到大量的NiR，這為今后的研究帶來困擾。為了更好地研究B. cereus LJ01中NiR的性質(zhì)，必須提高NiR的提取量。本研究利用克隆表達技術(shù)，將B. cereus LJ01中NiR基因片段克隆到原核表達載體Escherichia coli BL21上，利用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）對NiR進行誘導表達，從而得到大量的重組NiR，以便后續(xù)性質(zhì)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與載體

B. cereus LJ01、原核載體質(zhì)粒pET32a（+）、克隆宿主E. coli DH5α和表達宿主E. coli BL21（DE3）由本實驗室保存于-80 ℃冰箱中。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

核酸和蛋白電泳Marker、SalI限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit 50-prep試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；柱式細菌DNAout試劑盒、NcoI限制性內(nèi)切酶北京天恩澤基因科技有限公司；氨芐青霉素、IPTG、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、過硫酸鈉 廣州卯林試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基參照文獻[19]配制；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑的配制參照文獻[20]。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HYG-A全溫搖瓶柜 太倉市實驗設備廠；WD-9403B紫外儀、DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、JW-3021 HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司；親和層析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow 美國GE公司；5800 MALDI-TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀 德國Bruker公司；Chirascan圓二色譜儀英國應用光物理公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成

在NCBI中查找蠟樣芽孢桿菌中NiR蛋白序列（GenBank編號CP009628），然后根據(jù)蛋白序列的位點，在蠟樣芽孢桿菌的全基因組中找到其編碼基因的序列，根據(jù)找到的NiR編碼序列（nir）設計引物，即上游引物 Bc-NP1：5’-CATGCCATGGATGA GTTATGAAAAAGTAT-3’，下游引物Bc-NP2：5’-ACGCGTCGACCTAAGAGCTATTACTTCT-3’，下劃線為保護性堿基，分別從其中引入NcoI和SalI的酶切位點。引物由英濰捷基上海有限公司合成。

1.3.2 基因克隆和測序

用基因組DNA提取試劑盒抽提B. cereus LJ01的基因組DNA，以其為模板擴增nir片段。將PCR產(chǎn)物上樣至1%瓊脂糖凝膠中，在紫外燈下觀察結(jié)果，并利用QIAquick PCR Purification kit試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收，送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序[21]。將測得的DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列后，與GenBank收錄的NiR蛋白序列對比，將正確的NiR的DNA序列登錄GenBank。

1.3.3 重組菌株pET-32a（+）-nir-BL21的構(gòu)建

由于兩個限制性內(nèi)切酶的最適buffer不同，因此不進行雙酶切，而是分別進行單酶切。將回收的目的nir片段、pET-32a（+）質(zhì)粒分別進行NcoI和SalI單酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收酶切后的目的基因nir和pET-32a（+）[22-23]。利用T4 DNA連接酶將目的基因nir連接到pET載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a（+）-nir。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）中，同時向另兩個裝有E.coli BL21感受態(tài)細胞的離心管中分別加入空質(zhì)粒pET-32a（+）和無菌水（兩者均作為空白對照），用移液槍輕輕吹打混勻后冰浴30 min。

將3 個離心管均放入42 ℃的水浴鍋中保溫90 s后，快速冷卻細胞2～3 min。向每個離心管中分別加入800 μL液體LB培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)45 min，使細菌復蘇。分別取100 μL以上3 種培養(yǎng)液涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，觀察平板菌落生長情況。在重組質(zhì)粒組平板上隨機挑取10 個單菌落進行PCR鑒定。再將陽性菌株分別培養(yǎng)后，送菌液至生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.3.4 重組菌NiR的表達鑒定

將得到的陽性克隆菌種按2%接種量接種至LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL氨芐青霉素），于37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm=0.6）時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導，培養(yǎng)4 h時終止發(fā)酵，將培養(yǎng)液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心收集菌體，用無菌水清洗兩次，每100 mL培養(yǎng)液加入10 mL已4 ℃預冷的0.02 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4），同時加入終質(zhì)量濃度為2 μg/mL的胰蛋白酶抑制劑，冰浴超聲波破碎菌體，離心取上清液，記為NiR粗酶液。同時設立對照組，一組為加IPTG誘導的含有空質(zhì)粒的BL21組（陰性對照組），另一組為不加IPTG誘導的含重組質(zhì)粒的BL21組（陽性對照組），按同樣的方法收集粗酶液，在相同濃度下進行SDS-PAGE分析，以初步判斷NiR是否成功表達。

1.3.5 重組NiR的分離純化

利用親和層析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow分離純化得到目的蛋白，具體純化操作參照文獻[16]，并對相應組分進行酶活性測定。經(jīng)Ni柱分離后收集到的蛋白進行透析后濃縮，利用DEAE Sepharose Fast Flow對濃縮后的蛋白進行二次分離，先用不含NaCl的50 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.4）將雜蛋白洗脫下來，再用含0～300 mmol/L NaCl的50 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.4）進行梯度洗脫，流速為1 mL/min，分部收集洗脫液，每管收集洗脫液1.5 mL，測定每管洗脫液的蛋白含量、降解亞硝酸鹽的活性及NiR活性，收集和合并有NiR活性的組分，再用聚乙二醇20000濃縮至所需濃度，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。其中酶活性測定體系：在1.5 mL離心管中加入分別用0、100、200 mmol/L NaCl洗脫下來的洗脫液100 μL、500 mg/L的NaNO2100 μL、 0.1 mol/L亞硫酸鈉100 μL，再用HEPES緩沖液定容到500 μL，鹽酸萘乙二胺法測定殘留的亞硝酸鹽含量。NiR活性單位定義為：在37 ℃條件下，每分鐘每毫克蛋白催化還原亞硝酸鈉的質(zhì)量（ng）為一個酶活力單位。

1.3.6 重組NiR的性質(zhì)分析

Native-PAGE測定：利用樣品緩沖液將上述步驟中得到的重組蛋白進行樣品制備，凝膠為10 g/100 mL丙烯酰胺，電壓為120 V，整個電泳過程處于冰浴中，電泳2 h后，進行考馬斯亮藍染色，再脫色后拍照。

質(zhì)譜測定：通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對供試品的相對分子質(zhì)量進行分析。

圓二色譜測定：利用圓二色譜儀分別對重組蛋白、經(jīng)100 ℃高溫處理后的重組蛋白和經(jīng)高壓滅菌的重組蛋白進行二級結(jié)構(gòu)的測定，并用Pro-uta Viewer軟件分析結(jié)果。樣品分為3 組，分別為重組NiR、經(jīng)100 ℃加熱處理15 min后的重組NiR以及經(jīng)121 ℃高壓滅菌的重組NiR。

金屬含量的測定：利用電感耦合等離子體質(zhì)譜對重組NiR進行金屬含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因nir的PCR擴增

提取B. cereus LJ01的基因組DNA，并以此為模板得到的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如圖1，擴增出的條帶約1 600 bp ，條帶單一，明亮清晰。該大小與預計的編碼基因大小1 623 bp幾乎相一致，因此可以初步判定該條帶即為目的基因片段。將純化得到的基因片段送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序。測序結(jié)果表明NiR含有一個1 623 bp的開放閱讀框，編碼540 個氨基酸序列，將測得的DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列后，與GenBank收錄的相比，結(jié)果與B. thuringiensis strain XL6（Accession number：CP013000.1）的鐵氧化還原蛋白亞硝酸還原酶的堿基序列相似性達到99%。在B. thuringiensis strain XL6菌株中第1 610個堿基是鳥嘌呤（G），而LJ01對應的是胸腺嘧啶（T），相應地，第537個密碼子編碼的氨基酸由前者的纈氨酸變成了后者的甘氨酸，將編碼B. cereus LJ01中NiR蛋白的DNA序列上傳至NCBI中，獲得Accession number：MG839504。

圖1 B. cereus LJ01中nir基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Gel electrophoresis of PCR-amplified nir gene from B. cereus LJ01

2.2 重組表達載體的構(gòu)建結(jié)果

實驗中陰性組未長出菌落，而陽性組的菌落較多，說明感受態(tài)細胞制備成功。在重組菌平板上挑取10 個單菌落進行PCR初步鑒定，結(jié)果見圖2，其中只有3號和10號未擴增出條帶，其余8 株菌均能擴增出目的片段，說明挑取的10 株重組菌中，有8 株含有目標片段，將上述8 株重組菌分別培養(yǎng)后，送菌液至生工生物工程（上海）有限公司進行測序，測序結(jié)果均正確。

圖2 重組大腸桿菌的菌落PCR鑒定Fig. 2 PCR identification of recombinant E. coli

2.3 重組菌株中的NiR誘導表達及其分離純化

圖3 大腸桿菌中粗酶液的電泳圖Fig. 3 Electrophoresis of crude enzyme from E. coli

pET-32a（+）-nir-BL21中NiR的誘導表達結(jié)果如圖3所示，1、2條帶的蛋白基本一致，而與前兩條帶相比，條帶3在箭頭所指a、b和c的位置多出3 處條帶，說明該重組蛋白可能已經(jīng)成功得到表達。

圖4 重組NiR的親和層析Fig. 4 Affinity chromatography of recombinant NiR

將上述所得的重組蛋白粗酶液進行親和層析純化。重組NiR經(jīng)500 mmol/L咪唑洗脫曲線如圖4所示，收集后測定酶活性，經(jīng)計算其產(chǎn)量為1 L發(fā)酵液中可得到20～30 mg重組蛋白。

圖5 重組NiR的DEAE Sepharose Fast Flow層析Fig. 5 Chromatography of recombinant NiR on DEAE Sepharose Fast Flow

將經(jīng)親和層析柱洗脫后收集的蛋白再次濃縮，取40 mL上樣至DEAE Sepharose Fast Flow，其蛋白洗脫曲線如圖5所示。其中第1個峰的NaCl濃度為200 mmol/L，后一個峰的NaCl濃度為1 mol/L，說明大多數(shù)的重組NiR都在200 mmol/L的鹽濃度下被洗脫出來，且測得NiR活性為10 987.65 U/mg，說明經(jīng)克隆表達并純化出的是正確的NiR。洗脫出的酶液經(jīng)聚乙二醇20000濃縮后進行SDSPAGE檢測，其結(jié)果如圖6所示，對比條帶1和條帶2得出箭頭所指處為目的蛋白NiR，對照3、4、5條帶說明圖3中箭頭c所指的條帶為重組蛋白，同時發(fā)現(xiàn)其中還有少許雜帶，還需要進一步濃縮來提高其純度。

2.4 重組NiR的性質(zhì)分析

圖7 重組蛋白的非變性聚丙烯酰胺電泳圖Fig. 7 Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis of recombinant protein

將得到的重組蛋白進行非變性聚丙烯酰胺電泳檢測，結(jié)果見圖7，泳道1、2 均為單一條帶，說明樣品蛋白為單一蛋白，因此推測圖6中1、2道中上方的條帶為聚合物，同時重組蛋白較天然蛋白相比多了組氨酸頭，因此導致組成NiR的兩個單體分子質(zhì)量有所差異。圖7中按照分子質(zhì)量的遷移來看，重組NiR的分子質(zhì)量應略小于45 ku，約為40 ku，這和理論分子質(zhì)量（約60 ku）差距較大。之所以出現(xiàn)這種偏差，是由于在非變性聚丙烯酰胺電泳中，蛋白質(zhì)的遷移取決于許多因素，包括大小，形狀和電荷[24]，蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)也會影響條帶的遷移，因此無法憑借標準蛋白來確定重組NiR的準確分子質(zhì)量。有研究利用非變性聚丙烯酰胺電泳來分離純化蛋白[24-25]和研究蛋白間的相互作用[26]，而幾乎沒有利用非變性聚丙烯酰胺電泳來確定其天然分子質(zhì)量的研究。

圖8 不同狀態(tài)下重組NiR的非變性聚丙烯酰胺電泳圖Fig. 8 Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis of recombinant NiR under different conditions

為進一步確定空間結(jié)構(gòu)對蛋白遷移的影響，重組NiR經(jīng)不同處理后的非變性聚丙烯酰胺電泳結(jié)果見圖8， 1、2、3蛋白帶的位置沒有明顯變化，4蛋白帶明顯向下遷移，這可能是因為3號樣品是經(jīng)100 ℃加熱的，其空間變化不大，而4號樣品的處理條件為高溫高壓，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，因此遷移量與前3組有明顯區(qū)別。研究表明，高壓處理對如氨基酸、維生素和風味化合物等小分子無影響[27]，但是對球狀蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)有破壞性的影響，會破壞其非共價鍵[28]。因此不能通過非變性聚丙烯酰胺電泳來確定重組NiR的準確分子質(zhì)量，而是需要利用質(zhì)譜等方法來確定。

圖9 重組蛋白質(zhì)譜圖Fig. 9 Mass spectrometry of recombinant protein

重組NiR質(zhì)譜圖見圖9，根據(jù)其DNA大小推測得到的分子質(zhì)量約為57 ku，同時質(zhì)粒pET-32a（+）上有Histags等標簽，因此判定圖9中大小為67.185 218 8 ku的組分為重組NiR樣品的分子質(zhì)量。經(jīng)不同處理的重組蛋白的圓二色譜圖見圖10，和重組蛋白相比，100 ℃加熱后的重組蛋白其α-螺旋結(jié)構(gòu)含量有所降低，而經(jīng)高壓滅菌后的重組蛋白其α-螺旋結(jié)構(gòu)含量有明顯的下降。根據(jù)電感耦合等離子體質(zhì)譜的測定結(jié)果，重組NiR中鐵離子質(zhì)量濃度為0.034 mg/L，銅離子質(zhì)量濃度為0.123 mg/L，樣品質(zhì)量濃度為2/3 mg/mL，因此最后得到樣品中鐵離子含量為51 mg/kg，銅離子含量為184.5 mg/kg。據(jù)報道，無論是鐵離子還是銅離子，都可能對NiR的活性產(chǎn)生影響。在Cu型NiR中，存在I型Cu中心和II型Cu中心，其中I型Cu中心是電子轉(zhuǎn)移位點，II型Cu中心是酶催化位點[29]，說明Cu原子對于Cu型NiR的催化具有促進作用，同時研究表明，亞硝酸鹽與T2銅結(jié)合后可以提高該中心的氧化還原電位，從而使分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移更有利[5]。在菠菜中，NiR在鐵-硫簇的軸向位置與血紅素鐵結(jié)合，其中鐵-硫域為其活性中心[30]。而B. cereus LJ01中的NiR同時含有鐵離子和銅離子，而對于兩種金屬離子在NiR中的作用，還要進行下一步探討。

圖10 重組蛋白圓二色譜圖Fig. 10 Circular dichroism spectra of recombinant protein

3 結(jié) 論

采用克隆表達技術(shù)提高NiR的量，于NCBI上查找蠟樣芽孢桿菌中NiR的DNA序列，根據(jù)該序列設計引物，以B. cereus LJ01全基因為模板進行PCR擴增，將目的片段雙酶切后連接于質(zhì)粒pET-32a（+）上，再導入大腸桿菌BL21中，利用含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板對重組菌進行篩選，用菌落PCR和測序進行驗證，得到含重組質(zhì)粒的重組BL21。重組菌用IPTG進行誘導產(chǎn)酶，采用超聲破碎法離心收集得到重組菌的粗酶液，利用Ni柱親和層析和DEAE Sepharose Fast Flow交換層析對粗蛋白進行純化，并研究了重組NiR的性質(zhì)，結(jié)果表明：該NiR含有一個1 623 bp的開放閱讀框，編碼540 個氨基酸序列。重組NiR的分子質(zhì)量約為67 ku；該酶中同時存在鐵離子和銅離子，且含量分別為51.0 mg/kg和184.5 mg/kg；圓二色譜結(jié)果顯示α-螺旋結(jié)構(gòu)在重組NiR中所占比例最大。

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