黃 穎，高志明,2，吳彬嫻，林展拓，趙俊俊，方亞鵬,2,*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分[1]，約占乳清蛋白總量的50%。β-乳球蛋白分子質(zhì)量約為18.4 kDa[2]，等電點(diǎn)為5.1～5.3，含有162 個(gè)氨基酸殘基[3]，具有良好的凝膠，起泡和乳化性能[4]。在一定條件下，蛋白質(zhì)單體經(jīng)過(guò)構(gòu)象改變，β-折疊增多并重新排列而發(fā)生聚集[5-6]，這種聚集可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)納米纖維。蛋白質(zhì)納米纖維是蛋白質(zhì)在低pH值（例如pH 2.0～3.0）條件下進(jìn)行熱處理得到的長(zhǎng)直型自組裝產(chǎn)物，其直徑和長(zhǎng)度尺寸分別在2～5 nm和200 nm～15 μm范圍內(nèi)，是具有較大長(zhǎng)徑比的形狀各向異性材料。Dietler等[7]通過(guò)原子力顯微鏡表征了蛋白質(zhì)納米纖維的精細(xì)結(jié)構(gòu)，認(rèn)為蛋白質(zhì)納米纖維最初形成“原纖維”即單股聚集體，然后經(jīng)過(guò)螺旋纏繞逐步形成多股螺旋結(jié)構(gòu)，形成成熟的納米纖維。蛋白質(zhì)納米纖維具有許多特殊的物理化學(xué)特性以及生物特性，例如具有良好的表面活性和細(xì)胞穿透性[8-11]，可被用于藥物載體的構(gòu)建以強(qiáng)化細(xì)胞吸收。同時(shí)因其良好的流變特性，可用作增稠劑和凝膠填充物[12-13]。蛋白質(zhì)纖維聚集體具有特殊的表面活性。Mezzenga等[14]比較了天然β-乳球蛋白及其納米纖維在油水和汽水界面的吸附和剪切流變性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)熱處理蛋白形成的纖維聚集體可以吸附于油水界面，其界面剪切模量明顯高于天然蛋白質(zhì)。該研究還發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)化成纖維聚集體的多肽的存在有可能會(huì)提高蛋白界面吸附和乳化性質(zhì)。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，改變水相的pH值和離子強(qiáng)度，蛋白質(zhì)纖維聚集體在油水界面具有不同的排列模式，并產(chǎn)生不同的界面流變特性[15-16]。Gao Zhiming等[17]也曾對(duì)蛋白質(zhì)納米纖維的乳化活性做過(guò)報(bào)道。

蛋白質(zhì)纖維化轉(zhuǎn)變過(guò)程較長(zhǎng)（約4～10 h），其形成過(guò)程較為復(fù)雜。在纖維生成的不同階段，其產(chǎn)物的組成、結(jié)構(gòu)、尺寸以及界面性質(zhì)及乳化活性均不同。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)β-乳球蛋白在纖維形成的不同階段，研究其產(chǎn)物的界面及乳化活性，為其在食品工業(yè)中的合理利用提供理論依據(jù)，特別是富含蛋白質(zhì)的飲料[18-19]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用大豆油 市售；β-乳球蛋白（蛋白質(zhì)干基質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，其中β-乳球蛋白占95.9%） 美國(guó)Davisco食品公司；硫磺素T（thioflavin-T，ThT）、硅鎂型吸附劑/氟羅里硅土（Florisil分子篩，60～100 目） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Direct Q3型超純水機(jī) 美國(guó)Merck Millipore公司；FE-20 FiveEasy Plus pH計(jì) 梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；Multifuge高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡 日本電子Jeol公司；TRACKER界面流變儀 法國(guó)Teclis界面技術(shù)有限公司；PT-MR 2100型高速剪切乳化機(jī) 瑞士Kinematica公司；Mastersizer 2000型激光粒度儀 英國(guó)Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)納米纖維的制備

將β-乳球蛋白分散于去離子水中（2%），室溫?cái)嚢? h，使其充分水化。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分散液pH 2.0，置于80 ℃水浴鍋加熱20 h，此過(guò)程持續(xù)磁力攪拌，每隔2 h定時(shí)取樣，取出后立即浸沒(méi)在冰水混合物中，冷卻20 min，隨后保存于冰箱備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)納米纖維形成動(dòng)力學(xué)表征

將12.0 mg ThT溶解于10 mL去離子水中，充分溶解后，用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾，于4 ℃冰箱中避光保存。在制備β-乳球蛋白納米纖維的過(guò)程中，取不同加熱時(shí)間樣品2.98 mL，加入20 μL ThT儲(chǔ)藏液，均勻混合，反應(yīng)1 min后進(jìn)行測(cè)量。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為450 nm和482 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，電壓為400 mV。

1.3.3 透射電子顯微鏡

將β-乳球蛋白纖維分散液用pH 2.0的去離子水稀釋到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，在水浴超聲清洗裝置中以功率50%超聲處理10 min，促進(jìn)樣品分散。接著，用移液槍吸取10 μL樣品滴至銅網(wǎng)上，自然晾干，隨后用毛細(xì)管吸取2 g/100 mL的磷鎢酸（水浴超聲30 min，100%功率，且用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾）滴至樣品表層，再次晾干后進(jìn)行電鏡觀察。

1.3.4 界面吸附和界面流變行為分析

分別通過(guò)分析蛋白質(zhì)纖維聚集體在界面吸附過(guò)程中的界面張力變化和膨脹黏彈模量的變化分析其界面吸附行為和界面流變行為。取不同階段所形成的混合分散體系稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%并調(diào)pH 3.5后進(jìn)行界面分析，選取界面流變儀的懸滴模式檢測(cè)樣品在油-水界面上的吸附情況。量取5 mL混合分散液于樣品槽中，將U形樣品針浸入水相中，并通過(guò)馬達(dá)控制形成10 μL的油滴。該實(shí)驗(yàn)在室溫條件下進(jìn)行，測(cè)定時(shí)間持續(xù)12 000 s，測(cè)試頻率0.05 Hz，振幅10%。在檢測(cè)過(guò)程中，整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)保持平衡，避免外界振動(dòng)干擾測(cè)量。

由于食用大豆油中含有的少量小分子表面活性成分容易對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾，因此使用前需要進(jìn)行純化。參考Gaonkar等[20]的方法，在100 mL食用大豆油中加入3 g Florisil分子篩吸附劑，隨后攪拌0.5 h，靜置5 min，5 000 r/min離心20 min，再加入新的吸附劑，重復(fù)上述操作3 次，收集純化后的大豆油，利用界面流變儀測(cè)定去離子水的界面張力，直到其界面張力在30 min內(nèi)下降不超過(guò)0.5 mN/m即可滿(mǎn)足要求。純化后大豆油的密度為 0.914 2 g/cm3，去離子水與油相的界面張力為（27±0.1）mN/m。

1.3.5 乳液制備及表征

乳液的制備：將一定量的β-乳球蛋白纖維化產(chǎn)物用去離子水稀釋至一定濃度，并用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至3.5，加入大豆油，配成蛋白總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，油量體積分?jǐn)?shù)為10%的混合液，采用高速剪切進(jìn)行乳化20 000 r/min離心2 min，乳液中添加0.4 g/L的疊氮鈉防菌。

粒徑分析：以去離子水為分散介質(zhì)，采用Mastersizer 2000激光粒度儀測(cè)定乳液粒徑分布及平均粒徑。測(cè)定加樣前先將乳液輕微振蕩搖勻，再逐滴加至分散介質(zhì)中，直到信號(hào)滿(mǎn)足測(cè)試要求。分散相和連續(xù)相的折光指數(shù)分別采用1.475和1.33，遮光度為10%～20%，樣品的吸收率為0.1%，泵轉(zhuǎn)速為2 000 r/min。每個(gè)樣品平行測(cè)量3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-乳球蛋白納米纖維形成動(dòng)力學(xué)

圖1 加熱不同時(shí)間的β-乳球蛋白納米纖維的ThT熒光強(qiáng)度Fig. 1 Thioflavin T fluorescence intensity of β-lactoglobulin fibrils at different heating times

ThT熒光染色法是檢測(cè)蛋白質(zhì)纖維化的典型方法。ThT通過(guò)與蛋白質(zhì)纖維中β-折疊結(jié)構(gòu)的特異性結(jié)合而具有特定的熒光行為。該方法可以檢測(cè)β-折疊結(jié)構(gòu)的變化從而獲得纖維化程度的信息，即形成的蛋白質(zhì)纖維的數(shù)量。ThT熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，意味著形成的蛋白質(zhì)纖維越多[21-23]。從圖1可以看出，熒光強(qiáng)度隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加。在熱處理的前4 h內(nèi)熒光強(qiáng)度的增加較為緩慢，隨后則快速增加。大約10 h后，曲線(xiàn)出現(xiàn)平臺(tái)區(qū)，熒光強(qiáng)度值保持相對(duì)穩(wěn)定，意味著蛋白質(zhì)纖維化轉(zhuǎn)變已經(jīng)完成。本實(shí)驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象與其他蛋白質(zhì)相關(guān)現(xiàn)象類(lèi)似[18,24]。

2.2 β-乳球蛋白纖維聚集體形成過(guò)程中的形貌變化

如圖2所示，在開(kāi)始階段（圖2A），β-乳球蛋白呈現(xiàn)出均勻球狀，粒徑約為30～40 nm，分散良好。加熱0.5 h后（圖2B）可觀察到球狀蛋白粒徑開(kāi)始減小，而分布更加密集，可能由于蛋白質(zhì)的水解導(dǎo)致[25-26]。直到加熱2 h后（圖2D），開(kāi)始出現(xiàn)明顯的蛋白質(zhì)納米纖維，但纖維數(shù)量較少。進(jìn)一步加熱會(huì)導(dǎo)致纖維數(shù)量增加，直徑變粗（圖2E、F）。Mezzenga等[27]研究了纖維的形成機(jī)理及過(guò)程，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子在反應(yīng)初始階段發(fā)生水解，然后部分以β-折疊結(jié)構(gòu)為主的片段在靜電排斥力和疏水相互作用的平衡下進(jìn)行有序聚集，即自組裝作用，形成纖維狀聚集物。一旦纖維開(kāi)始形成，其生長(zhǎng)的進(jìn)程快且雙向進(jìn)行，最后形成具有長(zhǎng)直結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)纖維。從圖2可以得出，在蛋白質(zhì)纖維化轉(zhuǎn)變的不同階段，其產(chǎn)物的組成、形貌是不同的，意味著其界面性質(zhì)的差異。

圖2 加熱不同時(shí)間形成的β-乳球蛋白納米纖維的透射電子顯微鏡圖Fig. 2 TEM of β-lactoglobulin fibrils heated for different times

2.3 纖維化過(guò)程中β-乳球蛋白界面性質(zhì)的變化

圖3 纖維化過(guò)程中β-乳球蛋白在油水界面的吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程（A）及其飽和界面張力（B）的變化Fig. 3 Changes in adsorption kinetics (A) and saturated surface pressures (B) of β-lactoglobulin dispersions during fibrillation

乳液的形成及穩(wěn)定性決定于界面物質(zhì)的吸附行為和界面膜的黏彈模量[28-32]。采用懸滴法對(duì)β-乳球蛋白纖維化轉(zhuǎn)變過(guò)程中不同階段產(chǎn)物的界面吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程和界面膜的黏彈模量進(jìn)行研究。圖3A為各階段產(chǎn)物在油-水界面的界面張力隨時(shí)間的變化?？梢杂^察到，所有樣品的界面張力隨吸附時(shí)間逐漸上升，意味著不同階段產(chǎn)物均具有界面吸附行為。一段時(shí)間后界面張力上升速度趨于平緩，表明物質(zhì)在界面上的吸附逐漸達(dá)到飽和。從圖3B可以發(fā)現(xiàn)，纖維化轉(zhuǎn)變不同階段的產(chǎn)物，其平衡界面張力存在區(qū)別。在開(kāi)始階段，飽和界面張力隨蛋白加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，當(dāng)加熱時(shí)間超過(guò)2 h后，飽和界面張力的變化不再明顯。綜合上述分析可以看出，在熱處理的初始階段，蛋白質(zhì)發(fā)生了水解，這一現(xiàn)象使得蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變小，而擴(kuò)散速度增加，因而相對(duì)未水解的蛋白能達(dá)到更高的飽和界面張力。盡管過(guò)度水解會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)界面活性的破壞，但后期隨著納米纖維的形成，混合體系的整體界面活性仍然能保持較高水平。

圖4 纖維化過(guò)程中β-乳球蛋白在油/水界面的擴(kuò)張流變學(xué)特性Fig. 4 Changes in interfacial dilatational rheological properties of dispersions during fibrillation

如圖4A所示，隨著蛋白不斷吸附到油-水界面上（界面張力的增加），樣品的黏彈模量也不斷增加，說(shuō)明不同纖維化階段的產(chǎn)物在油/水界面存在明顯相互作用，使得界面層具有較強(qiáng)的黏彈性。同時(shí)隨著纖維化轉(zhuǎn)變的進(jìn)行（加熱時(shí)間的延長(zhǎng)），其界面黏彈模量逐漸升高，說(shuō)明纖維化轉(zhuǎn)變有利于界面吸附層的黏彈性的提高。如圖4B所示，隨著纖維化轉(zhuǎn)變的進(jìn)行，其飽和模量不斷升高，但在不同階段，其變化幅度不同。即在纖維化的初始階段上升較快，而后期則上升不明顯，這表示纖維化轉(zhuǎn)變的完成，體系中纖維的數(shù)量增加不再明顯，體系的界面黏彈模量的變化趨于平緩。蛋白質(zhì)納米纖維屬于形狀各向異性材料，其在油/水界面上的相互作用不同于一般的球形顆?；蛉嵝愿叻肿樱哂懈鼜?qiáng)的相互作用，因而能產(chǎn)生更高的界面黏彈性[33-37]。食品油/水界面或氣/水界面的穩(wěn)定依賴(lài)于界面膜的強(qiáng)度，即黏彈模量[38]。目前食品行業(yè)大多數(shù)采用的吐溫、蔗糖酯等小分子表面活性劑所形成的界面膜通常較弱，在食品儲(chǔ)藏過(guò)程中容易使界面失穩(wěn)，從而導(dǎo)致食品結(jié)構(gòu)的破壞（如奶油的乳析、植脂末的滲油等）。蛋白質(zhì)纖維聚集體所表現(xiàn)出的高界面強(qiáng)度則有助于上述問(wèn)題的解決。

2.4 纖維化過(guò)程對(duì)β-乳球蛋白乳化性的影響

圖5 纖維化轉(zhuǎn)變過(guò)程中β-乳球蛋白納米纖維穩(wěn)定的乳液外觀（A）、平均粒徑（B）和常溫貯藏時(shí)粒徑（C）的變化Fig. 5 Appearance (A), average droplet size (B) and storage stability (C)of emulsions stabilized by β-lactoglobulin dispersions during fibrillation

從圖5A可以看出，纖維化的各個(gè)階段的產(chǎn)物均能形成較為穩(wěn)定的油/水乳液，并且隨著纖維化程度提高，乳液中乳化層的厚度增加，意味著纖維化產(chǎn)物的乳化能力的提高。通過(guò)乳液的平均粒徑（圖5B）可以看出，乳液的粒徑隨著纖維化程度的提高而逐漸減小，直至纖維化轉(zhuǎn)變2 h后，其產(chǎn)物形成的乳液粒徑趨于穩(wěn)定，說(shuō)明其乳化能力的變化不再明顯，與圖5A圖現(xiàn)象一致。如圖5C所示，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，乳液的粒徑均有所上升，這是由于乳液在儲(chǔ)藏過(guò)程中乳滴之間發(fā)生了一定程度的絮凝或聚集。絮凝主要由于乳滴之間的靜電排斥力所致，而聚集則由于乳滴表面的界面強(qiáng)度不足所致。比較不同樣品在30 d儲(chǔ)藏過(guò)程中的粒徑變化發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)化的蛋白乳液平均粒徑增加了1.907 μm，而纖維化0.5～12 h的蛋白，其乳液的平均粒徑分別增加了0.63 μm（0.5 h），1.08 μm（1 h），1.09 μm（2 h），3.00 μm（5 h），2.80 μm（7 h）和3.20 μm（12 h）。由此可見(jiàn)，纖維化0.5 h的乳液相對(duì)最為穩(wěn)定，未經(jīng)纖維化轉(zhuǎn)變或過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的纖維化轉(zhuǎn)變均不利于乳液的穩(wěn)定性。纖維化轉(zhuǎn)變后，柔性蛋白分子轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸欢▌傂缘睦w維聚集體，該聚集體相對(duì)于蛋白分子具有更高的界面吸附能，從而提高了乳液的穩(wěn)定性。而長(zhǎng)時(shí)間的纖維化所導(dǎo)致的乳液穩(wěn)定性下降，可能由于連續(xù)相中的纖維產(chǎn)生的耗散性絮凝所導(dǎo)致[17]。在實(shí)際應(yīng)用中，乳化能力和乳化穩(wěn)定性需要同時(shí)考慮。較高的乳化能力有助于形成粒徑較小的乳滴，而乳化穩(wěn)定性有助于乳液保持長(zhǎng)期的穩(wěn)定性。綜合比較，纖維化2 h的蛋白質(zhì)較適宜于在食品乳化中的應(yīng)用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)β-乳球蛋白在纖維化轉(zhuǎn)變不同階段的產(chǎn)物進(jìn)行了表征，并對(duì)其界面及乳化行為進(jìn)行了分析研究。在纖維化轉(zhuǎn)變初期，蛋白質(zhì)發(fā)生水解，2 h后開(kāi)始形成少量纖維。隨時(shí)間延長(zhǎng)纖維數(shù)量則開(kāi)始增加，直徑變粗。通過(guò)對(duì)界面吸附行為和界面流變性分析可知，β-乳球蛋白的纖維化轉(zhuǎn)變可有效提高其界面活性，且增強(qiáng)了界面上蛋白分子間的相互作用。通過(guò)乳化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著纖維化轉(zhuǎn)變過(guò)程的延長(zhǎng)，其產(chǎn)物的乳化能力逐漸提高，但乳化穩(wěn)定性在開(kāi)始階段有所提高，后期逐漸下降。綜合比較，纖維化2 h的產(chǎn)物最適宜用于食品的乳化。

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