周瑤，唐毅，杜標(biāo)炎

(1湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南株洲412012；2湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院；3廣州中醫(yī)藥大學(xué))

黑色素瘤對(duì)放療、化療不敏感，且容易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，患者預(yù)后差[1,2]。山奈酚屬于黃酮類化合物，具有抗腫瘤作用，且毒副作用小，能提高正常皮膚的抗氧化能力，抑制皮膚損傷和腫瘤發(fā)生[3～5]?？p隙連接又稱信息連接，是相鄰細(xì)胞側(cè)面的一種跨膜通道，主要介導(dǎo)細(xì)胞間的物質(zhì)和信息交換，對(duì)細(xì)胞新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過(guò)程均具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，多種抗腫瘤藥物的活性成分可通過(guò)加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的縫隙連接通訊功能達(dá)到抗腫瘤的效應(yīng)。縫隙連接的基本單位為縫隙連接蛋白(Cx)，其在腫瘤細(xì)胞的形成和發(fā)展方面具有重要的調(diào)節(jié)作用[6,7]，其中以縫隙連接蛋白43(Cx43)在人體內(nèi)分布最廣、數(shù)量最多、與腫瘤聯(lián)系最為密切[8,9]。2016年1月～2017年3月我們從調(diào)節(jié)細(xì)胞間Cx43表達(dá)量和縫隙連接通訊的角度入手，觀察了山奈酚抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料山奈酚購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：60010，純度>97%)。小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640粉、胰蛋白酶和新生牛血清、Cx43一抗均購(gòu)自Gibco公司，青、鏈霉素雙抗合劑購(gòu)自Hyclone公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司。倒置顯微鏡(重慶COIC)，Bio-Rad-680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(日本Bio-Rad)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將B16細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第2天，棄掉原培養(yǎng)基，替換為含10% FBS+90% RPMI 1640+1%雙抗的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%時(shí)，1∶2胰酶消化傳代。

1.3山奈酚抑制B16細(xì)胞存活率的最佳濃度篩選將B16細(xì)胞接種于96孔板(2×104個(gè)/mL，每孔100 μL)培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L山奈酚，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔(100 μL/孔)。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處每孔吸光度(A)值。計(jì)算山奈酚對(duì)B16細(xì)胞的半數(shù)致死量。結(jié)果顯示，3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L山奈酚處理細(xì)胞72 h，細(xì)胞增殖抑制率分別為5.325%、12.148%、16.974%、34.345%、61.764%、77.716%，即不同劑量的山奈酚對(duì)B16細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用，其作用呈濃度依賴性。山奈酚對(duì)B16的半數(shù)致死濃度為34.38 μmol/L，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中山奈酚的藥物濃度選擇為12.5、25、50 μmol/L。

1.4山奈酚對(duì)B16細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)影響的觀察將細(xì)胞消化后接種于24孔板培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為四組，分別加入0(陰性對(duì)照)、12.5、25、50 μmol/L山奈酚，作用72 h，光鏡下觀察各組細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)變化。

1.5山奈酚對(duì)B16細(xì)胞縫隙連接通訊功能影響的觀察將細(xì)胞預(yù)先分為供體細(xì)胞組和接受細(xì)胞組，兩組分別設(shè)山奈酚0、12.5、25、50 μmol/L四個(gè)濃度，均藥物干預(yù)72 h；將各濃度組供體細(xì)胞用PBS洗1次，避光下將細(xì)胞與Calcein-Am 0.2 μL和CMTMR-Am 0.4 μL用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基共同孵育，1 h后消化計(jì)數(shù)，稀釋至5 000個(gè)/mL；另將各濃度接受細(xì)胞用PBS洗1次，按原濃度對(duì)應(yīng)組分別重新添加對(duì)應(yīng)濃度藥液，仍為0、12.5、25、50 μmol/L四個(gè)濃度；將稀釋好的供體細(xì)胞添加至對(duì)應(yīng)濃度的接受細(xì)胞組，每孔添加1 mL供體細(xì)胞懸浮液，孵育4 h；采用熒光示蹤法于熒光顯微鏡下計(jì)算每個(gè)供體細(xì)胞周圍含有Calcein-Am的接受細(xì)胞數(shù)目。

1.6山奈酚對(duì)B16細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)影響的觀察將細(xì)胞消化后接種于24孔板培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為四組，分別給予0、12.5、25、50 μmol/L山奈酚干預(yù)72 h，收集各組細(xì)胞，采用Western blotting法檢測(cè)Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)比較光鏡下可見(jiàn)陰性對(duì)照細(xì)胞密度高，形態(tài)多為菱形，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞核染色均勻。山奈酚組隨著山奈酚濃度的升高，鏡下細(xì)胞數(shù)量越來(lái)越少，細(xì)胞形態(tài)逐漸不規(guī)則，出現(xiàn)很多分支突起；上述變化以50 μmol/L組表現(xiàn)最為明顯，且細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯顆粒狀物質(zhì)。

2.2各組細(xì)胞縫隙連接通訊功能比較山奈酚作用于B16細(xì)胞72 h時(shí)，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)供體細(xì)胞貼壁不久即呈圓形，隨著山奈酚濃度的增加，每個(gè)黃色供體細(xì)胞旁的綠色接受細(xì)胞數(shù)目明顯增多。0、12.5、25、50 μmol/L山奈酚組每個(gè)供體細(xì)胞周圍接受細(xì)胞的個(gè)數(shù)分別為(1.95±1.35)、(7.10±2.12)、(13.48±5.36)、(35.13±6.09)個(gè)，各濃度間比較P均<0.01。

2.3各組Cx43蛋白表達(dá)比較0、12.5、25、50 μmol/L山奈酚組Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.17、0.28、0.48、0.83，各濃度間比較P均<0.01。

3　討論

山奈酚是一種研究較多的具有抗癌效應(yīng)的黃酮類化合物，主要來(lái)源于姜科植物山奈的根莖，在其他植物如蔬菜、水果、中藥材中也廣泛存在。已有大量研究報(bào)道，山奈酚對(duì)肝癌、胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、膽管癌、大鼠前列腺細(xì)胞癌、白血病等具有抗癌效應(yīng)，且安全無(wú)毒，具有良好的臨床應(yīng)用前景[4，9，11～16]。

縫隙連接是細(xì)胞間一種重要的細(xì)胞連接，能聯(lián)通相鄰兩側(cè)細(xì)胞，是細(xì)胞間重要的交通管道，供細(xì)胞間交換小分子物質(zhì)和離子等，以傳遞細(xì)胞間的化學(xué)信息，故又被稱為通信連接[17]。研究表明，縫隙連接通訊功能低下是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要原因，通過(guò)增強(qiáng)癌細(xì)胞間的縫隙連接通訊功能，加速細(xì)胞間化學(xué)物質(zhì)和化學(xué)信息的傳遞，是某些抗癌藥物起效的重要作用機(jī)制[18]。Cx是縫隙連接的物質(zhì)組成基礎(chǔ)，其表達(dá)可影響細(xì)胞間的縫隙連接通訊功能。研究顯示，通過(guò)對(duì)Cx低表達(dá)的腫瘤組織重新引入Cx使其恢復(fù)原有表達(dá)或過(guò)表達(dá)，均可抑制腫瘤的體外增殖和腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)[7]，說(shuō)明Cx與腫瘤關(guān)系密切，對(duì)腫瘤具有抑制作用。Cx43普遍存在于所有細(xì)胞中，是現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)，很多惡性腫瘤包括黑色素瘤均存在Cx43或縫隙連接通訊下調(diào)[19]。已有研究證實(shí)，抗癌藥物能通過(guò)改善腫瘤細(xì)胞膜上Cx43的表達(dá)量來(lái)促進(jìn)細(xì)胞間縫隙連接通訊功能，從而增強(qiáng)藥物的腫瘤殺傷效應(yīng)，并在腫瘤的自殺基因療法中使自殺基因系統(tǒng)的毒性產(chǎn)物更多地通過(guò)縫隙連接通道傳導(dǎo)到未轉(zhuǎn)染自殺基因的細(xì)胞中，進(jìn)而增強(qiáng)藥物的旁殺傷效應(yīng)[3]。

本研究結(jié)果顯示：山奈酚能體外抑制B16細(xì)胞增殖，光鏡下見(jiàn)山奈酚作用下細(xì)胞數(shù)量減少、形態(tài)變得不規(guī)則，且上述作用隨著藥物作用濃度的升高而增強(qiáng)。細(xì)胞接種熒光示蹤法顯示，經(jīng)山奈酚處理后的藥物組供體細(xì)胞旁的接受細(xì)胞數(shù)目顯著增加，且具有量效依賴性，說(shuō)明藥物組細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞功能增強(qiáng)，山奈酚能通過(guò)促進(jìn)B16細(xì)胞間縫隙連接通訊功能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，山奈酚上調(diào)B16細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)量，且有明顯的量效關(guān)系，初步揭示了山奈酚促進(jìn)B16細(xì)胞縫隙連接通訊功能的具體機(jī)制。

綜上所述，山奈酚可抑制小鼠黑素瘤B16細(xì)胞增殖，具有明確的抗腫瘤作用；促進(jìn)Cx43表達(dá)和縫隙連接通訊功能可能是其作用機(jī)制。

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