， ， ， ，乾勇，

[陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)與食品安全研究中心，重慶市營養(yǎng)與食品安全重點實驗室，重慶 400038]

肝是由多種細胞構(gòu)成，除了肝實質(zhì)細胞外，還存在大量的非實質(zhì)細胞，如肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)、各種免疫細胞(如T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞等)、血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞等[1]。HSC細胞是肝內(nèi)重要的非實質(zhì)細胞，不僅是人體維生素A的主要儲存場所，而且與多種肝疾病尤其是肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。在肝纖維化發(fā)生過程中，HSC細胞是肝內(nèi)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要來源，其細胞活化、分化和表型轉(zhuǎn)化對于肝纖維化疾病進程、診斷和治療具有重要意義[4]。由于人體活體肝組織標本來源有限，小動物(特別是小鼠和大鼠)是HSC細胞的主要來源。但是因為肝細胞種類的多樣性、HSC細胞數(shù)量有限以及HSC細胞分離純化具有較高的技術(shù)要求，獲得足夠數(shù)量的具有良好細胞活力的HSC細胞成為開展相關(guān)肝疾病研究的前提條件。大鼠是多種肝疾病研究的重要動物模型，本實驗室在既往大鼠原代HSC分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上[5-8]，對灌注、消化、純化等多個操作步驟進行了進一步的探索和方法優(yōu)化，建立了穩(wěn)定、高效的HSC細胞分離方法，獲得了數(shù)量更多、活力更高、表型穩(wěn)定的HSC細胞，為肝相關(guān)疾病研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠12只(12周齡)，購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))實驗動物中心，體質(zhì)量400～600 g，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 Ⅳ型膠原酶(Collagenase Ⅳ)、鏈蛋白酶(Pronase E)購自美國Sigma公司；DNA聚合酶Ⅰ(DNase Ⅰ)購自美國Roche公司；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EGTA)購自美國Sigma公司；Percoll密度梯度離心分離液購自上海前程生物科技有限公司；HBSS緩沖液、臺盼藍染色液購自上海碧云天生物技術(shù)公司；HEPES、胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum)為美國Hyclone公司產(chǎn)品；青霉素/鏈霉素雙抗溶液購自Gibco公司；兔抗鼠結(jié)蛋白(Desmin)單抗和兔抗鼠平滑肌蛋白(α-SMA)單抗購自美國Abcam公司；FITC標記的羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 注射泵(蘭格恒流泵有限公司，LSP01-1A)、倒置相差顯微鏡(Olympus公司)、倒置熒光顯微鏡及影像采集系統(tǒng)(Olympus公司)、臺式低速水平離心機(Cence湘儀離心機儀器有限公司，L530)、流式細胞儀(BD FACSAria Ⅲ)、酶標儀(美國，SpectraMax M5多功能酶標儀)、CASY快速細胞計數(shù)儀(Roche公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配置 消化酶稀釋液：500 mL的HBSS緩沖液中添加HEPES 1 190 mg和CaCl2280 mg,混勻，4 ℃保存。EGTA液：500 mL不含Ca2+和Mg2+的HBSS液中添加EGTA 95 mg、HEPES 1 190 mg及1%體積的雙抗溶液，混勻，4 ℃保存。Pronase E液：稱取28 mg Pronase E，溶解于70 mL消化酶稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用，用前40 ℃預(yù)熱。Collagenase Ⅳ液：稱取40 mg Collagenase Ⅳ，溶解于80 mL消化酶稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用，用前40 ℃預(yù)熱。Pronase E/Collagenase Ⅳ肝組織體外消化液：稱取25 mg Pronase E和25 mg Collagenase Ⅳ溶解于50 mL消化酶稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用。臨用前再加入0.5 mL DNase Ⅰ液混勻。GBSS-B離心稀釋液：CaCl2225 mg，葡萄糖 991 mg，KCl 370 mg，KH2PO430 mg，MgCl2210 mg，MgSO470 mg，Na2HPO475 mg，NaHCO3227 mg，NaCl 8 g加雙蒸水至1 L。過濾除菌待用，4 ℃保存。DNase Ⅰ液：稱取20 mg DNase Ⅰ，加入10 mL GBSS-A溶液中，混勻溶液，分裝為1 mL/管，-20 ℃保存。密度梯度離心液：9 mL Percoll與1 mL 10倍濃度PBS混勻配制生理濃度的Percoll(Stock Isotonic Percoll)，使用前用完全培養(yǎng)基和PBS分別稀釋到40%和60%的濃度。HSC細胞完全培養(yǎng)基:高糖DMEM培養(yǎng)基中添加20%胎牛血清、10 mmol/L HEPES及1%雙抗。上述液體以pH計調(diào)節(jié)pH值為7.35～7.4后，0.22 μM除菌過濾器過濾除菌。

1.2.2 肝原位灌注 5%水合氯醛麻醉大鼠(按體質(zhì)量8 μL/g)并固定在手術(shù)板上，75%乙醇消毒大鼠腹部。“工”形打開腹腔，暴露下腔靜脈及肝。下腔靜脈插管，夾閉上腔靜脈，剪開門靜脈。分別采用以下3種灌注方式灌入消化液，比較不同灌注方法對于肝細胞消化的效果：①嚴格控制灌注液體的溫度、流速和總灌注量。利用注射泵從下腔靜脈灌注預(yù)熱到40 ℃的EGTA液，勻速灌注(20 mL/min)，至肝完全變白，總灌注體積約200 mL；再灌注預(yù)熱至37 ℃的Pronase E溶液約50 mL，勻速灌注(10 mL/min)；進而灌注70 mL Collagenase Ⅳ溶液，勻速灌注(10 mL/min)，進行肝原位消化。灌注過程中，需要嚴格控制灌注液的溫度、速度及灌注液總體積，并注意觀察是否有滲漏。②灌注液體的溫度為室溫，不預(yù)熱，其他操作相同[9]。③采用注射器人工灌注，未使用注射泵，灌注速度非勻速，其他操作相同[10]。

1.2.3 肝組織離體消化 將肝從大鼠腹腔分離，放置于100 mm培養(yǎng)皿中，分別加入5 mL的Pronase E/Collagenase Ⅳ消化液或Collagenase Ⅳ液消化肝組織，比較2種消化方法對HSC細胞分離效果的差異。用眼科剪剪碎肝并用彎頭吸管充分吹打分散肝細胞，將不同消化液消化后的肝細胞懸液分別轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中，平板搖床緩慢振蕩消化25 min。向錐形瓶內(nèi)加入4 ℃預(yù)冷的完全培養(yǎng)基10 mL以終止消化，混勻后用70 nm篩網(wǎng)將細胞懸液過濾分裝于2個50 mL離心管中。

1.2.4 肝星狀細胞分離與純化 將上一步收集的肝細胞懸液于4 ℃、50×g低速離心5 min，收集上清液，并再以4 ℃、580×g離心10 min，小心吸棄大部分上清液，僅留約10 mL并加入120 μL的DNaseⅠ溶液，充分混勻。再加入GBSS-B溶液至50 mL，4 ℃、580×g離心10 min。棄上清，加入120 μL的DNaseⅠ溶液，混勻。取15 mL離心管依次緩慢加入60% Percoll 3 mL、40 % Percoll 3 mL及細胞懸液3 mL。將離心管放于低溫水平離心機中，1 380×g離心20 min。離心完畢后，可見離心管中部出現(xiàn)“戒指樣”乳白色環(huán)狀即為HSC細胞。小心吸取中間層HSC細胞至50 mL離心管，用GBSS-B溶液洗滌細胞。4 ℃、580×g離心10 min，加入完全培養(yǎng)基重懸。細胞分離流程如圖1所示。采用CASY快速細胞計數(shù)儀測定每只大鼠收獲的HSC細胞數(shù)量，實驗至少重復(fù)3次，計算平均值。

a:下腔靜脈插管;b:灌注前準備;c:原位消化;d:分離肝臟;e:體外消化;f:離心和洗滌細胞;g:密度梯度制備及離心;h:吸取中間層HSC;i:離心洗滌細胞

圖1大鼠肝星狀細胞分離示意圖

1.2.5 原代細胞培養(yǎng)及生長狀態(tài)觀察 HSC細胞原代培養(yǎng)：用含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)，細胞以4×105/mL接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37 ℃、100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。36～48 h后更換培養(yǎng)基，改用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，以后每2 d更換1次培養(yǎng)液。倒置相差顯微鏡觀察原代HSC細胞形態(tài)學(xué)變化。臺盼藍拒染實驗：吸取40 μL細胞懸液，加入0.4%臺盼藍溶10 μL，混勻后倒置顯微鏡下未著色者為活細胞，計數(shù)活細胞數(shù)量。細胞存活率=(光鏡下一個視野中活細胞數(shù)/視野中細胞總數(shù))×100%。隨機選擇10個視野，計算細胞存活率并取平均值。CCK-8實驗：原代HSC細胞以0.25%胰酶消化液消化后，用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋細胞懸液至5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，每天按照每孔10 μL加入CCK-8溶液，孵育1 h，用酶標儀在波長為450 nm測定各孔吸光度值，根據(jù)測定結(jié)果制做HSC細胞生長曲線。

1.2.6 細胞鑒定 流式細胞術(shù)檢測細胞純度：取剛分離的原代HSC細胞，離心后用1 mL PBS重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為107/mL，于流式細胞儀計數(shù)熒光細胞數(shù)，并通過流式細胞儀測定HSC細胞純度，實驗至少重復(fù)3次，取平均值。免疫熒光細胞化學(xué)染色檢測細胞純度：原代HSC細胞以0.25%胰酶消化液消化后，用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋細胞懸液至5×104/mL，接種于放有爬片的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，用固定液固定10 min后，再用PBS漂洗3次，羊血清封閉30 min；分別加入抗-Desmin或抗-α-SMA一抗工作液，4 ℃孵育過夜。然后，以PBS輕洗細胞3次，每次5 min后，加入FITC標記的羊抗兔IgG二抗工作液，室溫孵育60 min。PBS輕洗細胞3次，每次5 min。加入細胞核染液DAPI，室溫孵育5 min；PBS輕洗細胞3次，每次5 min，甘油封片。置于熒光顯微鏡下觀察、照相并分析HSC細胞內(nèi)Desmin和α-SMA的表達情況。根據(jù)Desmin陽性細胞數(shù)計算細胞純度，細胞純度=(結(jié)蛋白陽性細胞/細胞總數(shù))×100%，實驗至少重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HSC細胞形態(tài)學(xué)觀察

置于倒置相差顯微鏡下，觀察到新分離的HSC細胞呈圓形，折光性強，懸浮于培養(yǎng)液中(圖2a)。24 h后大部分細胞已貼壁，呈扁圓型，內(nèi)含光亮的脂滴，少量細胞已開始伸展(圖2b)；培養(yǎng)7 d后，HSC細胞已充分展開，體積明顯增大，細胞呈典型的星形或多邊形；細胞內(nèi)顆粒明顯減少，細胞逐漸融合，增殖速度加快，并呈局灶性生長，呈完全活化狀態(tài)(圖2c)；傳代后，HSC細胞體積逐漸變大，成纖維化發(fā)展，單層生長，鋪滿瓶底，細胞呈典型的成纖維細胞樣形態(tài)(圖2d)。HSC細胞在培養(yǎng)過程中，其形態(tài)發(fā)生明顯改變，即由靜息狀態(tài)向活化的肌成纖維細胞樣轉(zhuǎn)化。

2.2 HSC細胞生長曲線

根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果制作HSC細胞生長曲線(圖3)，結(jié)果表明，在接種后至第3天，細胞生長較緩慢，逐漸貼附于培養(yǎng)瓶底并伸展開；從第3天起，細胞進入指數(shù)生長期，細胞數(shù)量迅速增加；至第9天，細胞生長進入平臺期；至第11天后細胞生長逐漸減慢。

a：剛分離的原代HSC細胞；b：原代HSC細胞培養(yǎng)24 h；c：原代HSC細胞培養(yǎng)7 d；d：原代HSC細胞傳代培養(yǎng)第1代

圖2倒置相差顯微鏡觀察原代培養(yǎng)的大鼠HSC細胞(×200)

圖3 原代HSC細胞生長曲線

2.3 不同灌注和分離方法的比較

采用3種不同灌注方法分離肝HSC細胞并比較細胞收獲數(shù)量，結(jié)果顯示，采用嚴格控制灌注液體的溫度和流速，分離得到的大鼠HSC細胞數(shù)量最多，采用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液(聯(lián)合組)每只大鼠約收獲(2.1±0.2)×107個，而采用Collagenase Ⅳ消化液(單獨組)每只大鼠約收獲(1.7±0.2)×107個，均分別顯著高于采用相同消化方法條件下的其他兩種灌注方法(不控制溫度/控流、控溫/不控制流速)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。同時，在控溫/控流速條件下，使用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液和單獨使用Collagenase Ⅳ消化液相比，前者收獲的HSC細胞更多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

分離的HSC細胞經(jīng)臺盼藍染色，結(jié)果顯示，采用控溫/控流速的灌注方法，在使用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液條件下獲得的HSC細胞存活率和使用Collagenase Ⅳ消化液條件下獲得的HSC細胞存活率，均分別顯著高于采用相同消化方法條件下的其他兩種灌注方式，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。利用流式細胞儀檢測新鮮分離的HSC細胞在熒光顯微鏡下(405 nm)能自發(fā)出藍色熒光的細胞數(shù)(圖4a)，比較不同灌注和消化方法得到的細胞純度的差異。結(jié)果顯示：采用控溫/控流速的灌注方法，在使用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液條件下收獲的HSC細胞純度顯著高于相同消化方法條件下的其他兩種灌注方式，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，嚴格控制灌注液體的溫度、流速和灌注量(即控溫、控流、控時)的方式分離HSC細胞，以及采用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液，獲得的HSC細胞數(shù)量更多，且HSC細胞存活率和純度也顯著提高。

2.4 HSC細胞鑒定

2.4.1 流式細胞儀鑒定HSC細胞 HSC細胞具有自發(fā)熒光特性，能夠在405 nm波長的激發(fā)光下發(fā)出極易淬滅的藍色熒光。利用此自發(fā)熒光特性，檢測經(jīng)流式細胞儀分選收獲的HSC細胞，發(fā)現(xiàn)具有自發(fā)熒光特性的細胞所占比例為96.3%(圖4b)；將分選的細胞在熒光顯微鏡下觀察，可見HSC細胞(圖4c)。結(jié)果表明，通過前述方法分離的細胞為HSC細胞，并且具有較高細胞純度。

表1 不同灌注和消化方法對分離原代HSC細胞的收獲數(shù)量、存活率和純度的影響)

a：與相同消化方法不控制溫度/控流速比較，P<0.05；b：與相同消化方法下控溫/不控制流速比較，P<0.05；c：與同灌注方法下，單獨組比較，P<0.05

a：流式細胞分選后光鏡下觀察HSC細胞(×100)；b:流式細胞儀測定自發(fā)熒光細胞比例；c：流式細胞分選后熒光顯微鏡下見HSC細胞(×100)

圖4流式細胞儀鑒定分離的原代HSC細胞

2.4.2 免疫熒光細胞化學(xué)染色鑒定HSC細胞 如圖5所示，將HSC細胞進行免疫熒光細胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示，剛分離的HSC細胞Desmin表達呈陽性，α-SMA表達呈陰性(圖5a、e)。傳代培養(yǎng)的HSC細胞，α-SMA和Desmin染色均呈陽性(圖5b、c、e、f)。根據(jù)HSC細胞的表型特征，證實分離獲得的細胞為HSC細胞。

3 討論

肝細胞由實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞組成。在各種非實質(zhì)細胞中，HSC細胞具有重要的生物學(xué)作用，與多種肝疾病特別是肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)[11-12]。HSC細胞是肝內(nèi)ECM的主要來源，對維持肝內(nèi)微環(huán)境的動態(tài)平衡有重要作用，因此在肝纖維化發(fā)生中起核心作用[13]。因此，肝纖維化研究通常以HSC細胞作為研究對象，探討其在肝纖維化發(fā)生中的作用機制，并尋找有效的防治方法。原代HSC細胞主要來源于實驗動物的肝，獲得足夠的高純度的HSC是順利開展肝纖維化相關(guān)研究的重要保證。因此，建立穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟、可靠的HSC分離、培養(yǎng)技術(shù)，對研究肝疾病特別是肝纖維化具有重要意義。

a:原代培養(yǎng)2 d α-SMA表達(×200);b:傳代培養(yǎng)第2代α-SMA的表達(×200);c:傳代培養(yǎng)第2代α-SMA的表達(×630);d:原代培養(yǎng)2 d Desmin表達(×200);e:傳代培養(yǎng)第2代Desmin的表達(×200);f:傳代培養(yǎng)第2代Desmin的表達(×630)

圖5免疫熒光細胞化學(xué)染色顯示大鼠HSC細胞Desmin和α-SMA的表達

HSC細胞位于肝的Disse間隙內(nèi)，在正常肝組織中，占肝細胞總數(shù)的5%～15%[14]。在正常肝內(nèi)，HSC細胞被認為處于靜息狀態(tài)。此時HSCs細胞胞質(zhì)富含維生素A和脂質(zhì)小滴，儲備著人體80%左右的維生素A，高表達GFAP、Desmin等蛋白。當各種因素如病毒感染、炎癥因子等刺激下，HSC細胞可由靜息型轉(zhuǎn)化為活化型表型，且胞質(zhì)內(nèi)維生素A逐漸丟失，高表達α-SMA，同時其具有收縮和分泌膠原的特性，能產(chǎn)生大量ECM[15-17]。HSC細胞的分離在國外最早始于1876年[18]，但其分離的細胞得率和純度均較低。我國到90年代開始探索HSC的分離方法，但不同實驗室采用的分離方法在純度、得率、存活率等方面均有不同程度的欠缺[7,10,19-21]。本實驗室長期開展肝相關(guān)疾病的研究，在既往大鼠原代HSC分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，對灌注、消化、純化等多個操作步驟進行了進一步的探索和方法優(yōu)化，建立了穩(wěn)定、高效的HSC細胞分離方法，獲得了數(shù)量更多、活力更高、表型穩(wěn)定的HSC細胞，為肝相關(guān)疾病研究奠定了實驗基礎(chǔ)[22-23]。

為提高HSC細胞的收獲數(shù)量和純度，我們率先采用控溫、控流、控時的肝逆向兩步酶灌流法進行原位組織消化；進而用Percoll密度梯度離心分離純化HSC細胞；最后采用流式自熒光分選大大提高了細胞純度。本實驗改良了大鼠HSC的分離方法，具體技術(shù)要點改進如下：①采用控溫、控流、控時的肝逆向兩步酶灌流法大大提高了可重復(fù)性和細胞收獲數(shù)量。由于溫度對酶的活性影響較大，對灌注的液體溫度嚴格控制在37 ℃，可以大大減少溫度變化對酶活力的影響，維持酶的最大消化效果[7]。②在灌注的不同階段，對灌注液體速度進行了嚴格控制。灌注EGTA液時要求壓力高、速度快，有利于快速沖洗出肝中的血液及其他雜質(zhì)；而灌注膠原酶時，需要酶液和肝充分接觸。因此，采用注射泵嚴格控制灌流速度，靈活控制酶與肝組織的接觸時間，通過多次探索確定了最優(yōu)化的灌注參數(shù)，從而達到更好的消化效果。③嚴格控制灌注時間，防止過度消化，提高細胞活力。④密度梯度介質(zhì)的選擇及密度梯度離心體系的建立是純化HSC細胞、提高HSC細胞收獲數(shù)量和細胞純度的重要步驟。本研究選用Precoll密度離心液，與其他文獻中使用的密度梯度離心材料(如Optiprep[10]、Nycodenz[24]梯度離心分離液等)相比，Precoll具有相對更多的優(yōu)點。Precoll是一種被乙烯吡咯烷酮包被的硅膠顆粒，無毒性，能形成連續(xù)梯度和不連續(xù)的兩種梯度。梯度的穩(wěn)定性意味著可以實現(xiàn)混合細胞中不同細胞種類的有效分層。而且Percoll很容易從被純化細胞中去除，不影響被分離細胞進一步的研究[25]。另外，選擇水平低溫離心機及正確的離心轉(zhuǎn)數(shù)也非常重要，梯度離心時將離心機調(diào)節(jié)為無剎車狀態(tài)更加利于形成梯度離心后的細胞分層。⑤采用流式細胞儀鑒定和純化細胞，根據(jù)HSC細胞表型分選HSC細胞，可以有效提高HSC細胞純度。

本實驗通過對大鼠HSC細胞分離、純化、鑒定等方法進行了改進，建立了較穩(wěn)定的大鼠HSC細胞分離和培養(yǎng)方法，為進一步開展針對HSC細胞的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，該分離培養(yǎng)方法值得推廣和應(yīng)用。

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