, , , ,乾勇,
[陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品安全研究中心,重慶市營(yíng)養(yǎng)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400038]
肝是由多種細(xì)胞構(gòu)成,除了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞外,還存在大量的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,如肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)、各種免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等[1]。HSC細(xì)胞是肝內(nèi)重要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,不僅是人體維生素A的主要儲(chǔ)存場(chǎng)所,而且與多種肝疾病尤其是肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中,HSC細(xì)胞是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的主要來(lái)源,其細(xì)胞活化、分化和表型轉(zhuǎn)化對(duì)于肝纖維化疾病進(jìn)程、診斷和治療具有重要意義[4]。由于人體活體肝組織標(biāo)本來(lái)源有限,小動(dòng)物(特別是小鼠和大鼠)是HSC細(xì)胞的主要來(lái)源。但是因?yàn)楦渭?xì)胞種類(lèi)的多樣性、HSC細(xì)胞數(shù)量有限以及HSC細(xì)胞分離純化具有較高的技術(shù)要求,獲得足夠數(shù)量的具有良好細(xì)胞活力的HSC細(xì)胞成為開(kāi)展相關(guān)肝疾病研究的前提條件。大鼠是多種肝疾病研究的重要?jiǎng)游锬P?,本?shí)驗(yàn)室在既往大鼠原代HSC分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上[5-8],對(duì)灌注、消化、純化等多個(gè)操作步驟進(jìn)行了進(jìn)一步的探索和方法優(yōu)化,建立了穩(wěn)定、高效的HSC細(xì)胞分離方法,獲得了數(shù)量更多、活力更高、表型穩(wěn)定的HSC細(xì)胞,為肝相關(guān)疾病研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠12只(12周齡),購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體質(zhì)量400~600 g,常規(guī)喂養(yǎng)。
1.1.2 主要試劑 Ⅳ型膠原酶(Collagenase Ⅳ)、鏈蛋白酶(Pronase E)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DNA聚合酶Ⅰ(DNase Ⅰ)購(gòu)自美國(guó)Roche公司;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EGTA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Percoll密度梯度離心分離液購(gòu)自上海前程生物科技有限公司;HBSS緩沖液、臺(tái)盼藍(lán)染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司;HEPES、胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum)為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品;青霉素/鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自Gibco公司;兔抗鼠結(jié)蛋白(Desmin)單抗和兔抗鼠平滑肌蛋白(α-SMA)單抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
1.1.3 主要儀器 注射泵(蘭格恒流泵有限公司,LSP01-1A)、倒置相差顯微鏡(Olympus公司)、倒置熒光顯微鏡及影像采集系統(tǒng)(Olympus公司)、臺(tái)式低速水平離心機(jī)(Cence湘儀離心機(jī)儀器有限公司,L530)、流式細(xì)胞儀(BD FACSAria Ⅲ)、酶標(biāo)儀(美國(guó),SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀)、CASY快速細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Roche公司)。
1.2.1 試劑配置 消化酶稀釋液:500 mL的HBSS緩沖液中添加HEPES 1 190 mg和CaCl2280 mg,混勻,4 ℃保存。EGTA液:500 mL不含Ca2+和Mg2+的HBSS液中添加EGTA 95 mg、HEPES 1 190 mg及1%體積的雙抗溶液,混勻,4 ℃保存。Pronase E液:稱(chēng)取28 mg Pronase E,溶解于70 mL消化酶稀釋液,現(xiàn)配現(xiàn)用,用前40 ℃預(yù)熱。Collagenase Ⅳ液:稱(chēng)取40 mg Collagenase Ⅳ,溶解于80 mL消化酶稀釋液,現(xiàn)配現(xiàn)用,用前40 ℃預(yù)熱。Pronase E/Collagenase Ⅳ肝組織體外消化液:稱(chēng)取25 mg Pronase E和25 mg Collagenase Ⅳ溶解于50 mL消化酶稀釋液,現(xiàn)配現(xiàn)用。臨用前再加入0.5 mL DNase Ⅰ液混勻。GBSS-B離心稀釋液:CaCl2225 mg,葡萄糖 991 mg,KCl 370 mg,KH2PO430 mg,MgCl2210 mg,MgSO470 mg,Na2HPO475 mg,NaHCO3227 mg,NaCl 8 g加雙蒸水至1 L。過(guò)濾除菌待用,4 ℃保存。DNase Ⅰ液:稱(chēng)取20 mg DNase Ⅰ,加入10 mL GBSS-A溶液中,混勻溶液,分裝為1 mL/管,-20 ℃保存。密度梯度離心液:9 mL Percoll與1 mL 10倍濃度PBS混勻配制生理濃度的Percoll(Stock Isotonic Percoll),使用前用完全培養(yǎng)基和PBS分別稀釋到40%和60%的濃度。HSC細(xì)胞完全培養(yǎng)基:高糖DMEM培養(yǎng)基中添加20%胎牛血清、10 mmol/L HEPES及1%雙抗。上述液體以pH計(jì)調(diào)節(jié)pH值為7.35~7.4后,0.22 μM除菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌。
1.2.2 肝原位灌注 5%水合氯醛麻醉大鼠(按體質(zhì)量8 μL/g)并固定在手術(shù)板上,75%乙醇消毒大鼠腹部?!肮ぁ毙未蜷_(kāi)腹腔,暴露下腔靜脈及肝。下腔靜脈插管,夾閉上腔靜脈,剪開(kāi)門(mén)靜脈。分別采用以下3種灌注方式灌入消化液,比較不同灌注方法對(duì)于肝細(xì)胞消化的效果:①?lài)?yán)格控制灌注液體的溫度、流速和總灌注量。利用注射泵從下腔靜脈灌注預(yù)熱到40 ℃的EGTA液,勻速灌注(20 mL/min),至肝完全變白,總灌注體積約200 mL;再灌注預(yù)熱至37 ℃的Pronase E溶液約50 mL,勻速灌注(10 mL/min);進(jìn)而灌注70 mL Collagenase Ⅳ溶液,勻速灌注(10 mL/min),進(jìn)行肝原位消化。灌注過(guò)程中,需要嚴(yán)格控制灌注液的溫度、速度及灌注液總體積,并注意觀察是否有滲漏。②灌注液體的溫度為室溫,不預(yù)熱,其他操作相同[9]。③采用注射器人工灌注,未使用注射泵,灌注速度非勻速,其他操作相同[10]。
1.2.3 肝組織離體消化 將肝從大鼠腹腔分離,放置于100 mm培養(yǎng)皿中,分別加入5 mL的Pronase E/Collagenase Ⅳ消化液或Collagenase Ⅳ液消化肝組織,比較2種消化方法對(duì)HSC細(xì)胞分離效果的差異。用眼科剪剪碎肝并用彎頭吸管充分吹打分散肝細(xì)胞,將不同消化液消化后的肝細(xì)胞懸液分別轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中,平板搖床緩慢振蕩消化25 min。向錐形瓶?jī)?nèi)加入4 ℃預(yù)冷的完全培養(yǎng)基10 mL以終止消化,混勻后用70 nm篩網(wǎng)將細(xì)胞懸液過(guò)濾分裝于2個(gè)50 mL離心管中。
1.2.4 肝星狀細(xì)胞分離與純化 將上一步收集的肝細(xì)胞懸液于4 ℃、50×g低速離心5 min,收集上清液,并再以4 ℃、580×g離心10 min,小心吸棄大部分上清液,僅留約10 mL并加入120 μL的DNaseⅠ溶液,充分混勻。再加入GBSS-B溶液至50 mL,4 ℃、580×g離心10 min。棄上清,加入120 μL的DNaseⅠ溶液,混勻。取15 mL離心管依次緩慢加入60% Percoll 3 mL、40 % Percoll 3 mL及細(xì)胞懸液3 mL。將離心管放于低溫水平離心機(jī)中,1 380×g離心20 min。離心完畢后,可見(jiàn)離心管中部出現(xiàn)“戒指樣”乳白色環(huán)狀即為HSC細(xì)胞。小心吸取中間層HSC細(xì)胞至50 mL離心管,用GBSS-B溶液洗滌細(xì)胞。4 ℃、580×g離心10 min,加入完全培養(yǎng)基重懸。細(xì)胞分離流程如圖1所示。采用CASY快速細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定每只大鼠收獲的HSC細(xì)胞數(shù)量,實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,計(jì)算平均值。
a:下腔靜脈插管;b:灌注前準(zhǔn)備;c:原位消化;d:分離肝臟;e:體外消化;f:離心和洗滌細(xì)胞;g:密度梯度制備及離心;h:吸取中間層HSC;i:離心洗滌細(xì)胞
圖1大鼠肝星狀細(xì)胞分離示意圖
1.2.5 原代細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 HSC細(xì)胞原代培養(yǎng):用含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),細(xì)胞以4×105/mL接種于50 mL培養(yǎng)瓶中,置于5%CO2、37 ℃、100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。36~48 h后更換培養(yǎng)基,改用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),以后每2 d更換1次培養(yǎng)液。倒置相差顯微鏡觀察原代HSC細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn):吸取40 μL細(xì)胞懸液,加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶10 μL,混勻后倒置顯微鏡下未著色者為活細(xì)胞,計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞存活率=(光鏡下一個(gè)視野中活細(xì)胞數(shù)/視野中細(xì)胞總數(shù))×100%。隨機(jī)選擇10個(gè)視野,計(jì)算細(xì)胞存活率并取平均值。CCK-8實(shí)驗(yàn):原代HSC細(xì)胞以0.25%胰酶消化液消化后,用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液至5×104/mL,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL,每天按照每孔10 μL加入CCK-8溶液,孵育1 h,用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm測(cè)定各孔吸光度值,根據(jù)測(cè)定結(jié)果制做HSC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
1.2.6 細(xì)胞鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度:取剛分離的原代HSC細(xì)胞,離心后用1 mL PBS重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為107/mL,于流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞數(shù),并通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定HSC細(xì)胞純度,實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,取平均值。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞純度:原代HSC細(xì)胞以0.25%胰酶消化液消化后,用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液至5×104/mL,接種于放有爬片的24孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基,PBS漂洗3次,用固定液固定10 min后,再用PBS漂洗3次,羊血清封閉30 min;分別加入抗-Desmin或抗-α-SMA一抗工作液,4 ℃孵育過(guò)夜。然后,以PBS輕洗細(xì)胞3次,每次5 min后,加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗工作液,室溫孵育60 min。PBS輕洗細(xì)胞3次,每次5 min。加入細(xì)胞核染液DAPI,室溫孵育5 min;PBS輕洗細(xì)胞3次,每次5 min,甘油封片。置于熒光顯微鏡下觀察、照相并分析HSC細(xì)胞內(nèi)Desmin和α-SMA的表達(dá)情況。根據(jù)Desmin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算細(xì)胞純度,細(xì)胞純度=(結(jié)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù))×100%,實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,取平均值。
置于倒置相差顯微鏡下,觀察到新分離的HSC細(xì)胞呈圓形,折光性強(qiáng),懸浮于培養(yǎng)液中(圖2a)。24 h后大部分細(xì)胞已貼壁,呈扁圓型,內(nèi)含光亮的脂滴,少量細(xì)胞已開(kāi)始伸展(圖2b);培養(yǎng)7 d后,HSC細(xì)胞已充分展開(kāi),體積明顯增大,細(xì)胞呈典型的星形或多邊形;細(xì)胞內(nèi)顆粒明顯減少,細(xì)胞逐漸融合,增殖速度加快,并呈局灶性生長(zhǎng),呈完全活化狀態(tài)(圖2c);傳代后,HSC細(xì)胞體積逐漸變大,成纖維化發(fā)展,單層生長(zhǎng),鋪滿瓶底,細(xì)胞呈典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(圖2d)。HSC細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中,其形態(tài)發(fā)生明顯改變,即由靜息狀態(tài)向活化的肌成纖維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化。
根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果制作HSC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖3),結(jié)果表明,在接種后至第3天,細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢,逐漸貼附于培養(yǎng)瓶底并伸展開(kāi);從第3天起,細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞數(shù)量迅速增加;至第9天,細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期;至第11天后細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減慢。
a:剛分離的原代HSC細(xì)胞;b:原代HSC細(xì)胞培養(yǎng)24 h;c:原代HSC細(xì)胞培養(yǎng)7 d;d:原代HSC細(xì)胞傳代培養(yǎng)第1代
圖2倒置相差顯微鏡觀察原代培養(yǎng)的大鼠HSC細(xì)胞(×200)
圖3 原代HSC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
采用3種不同灌注方法分離肝HSC細(xì)胞并比較細(xì)胞收獲數(shù)量,結(jié)果顯示,采用嚴(yán)格控制灌注液體的溫度和流速,分離得到的大鼠HSC細(xì)胞數(shù)量最多,采用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液(聯(lián)合組)每只大鼠約收獲(2.1±0.2)×107個(gè),而采用Collagenase Ⅳ消化液(單獨(dú)組)每只大鼠約收獲(1.7±0.2)×107個(gè),均分別顯著高于采用相同消化方法條件下的其他兩種灌注方法(不控制溫度/控流、控溫/不控制流速),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。同時(shí),在控溫/控流速條件下,使用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液和單獨(dú)使用Collagenase Ⅳ消化液相比,前者收獲的HSC細(xì)胞更多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
分離的HSC細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色,結(jié)果顯示,采用控溫/控流速的灌注方法,在使用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液條件下獲得的HSC細(xì)胞存活率和使用Collagenase Ⅳ消化液條件下獲得的HSC細(xì)胞存活率,均分別顯著高于采用相同消化方法條件下的其他兩種灌注方式,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)新鮮分離的HSC細(xì)胞在熒光顯微鏡下(405 nm)能自發(fā)出藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)(圖4a),比較不同灌注和消化方法得到的細(xì)胞純度的差異。結(jié)果顯示:采用控溫/控流速的灌注方法,在使用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液條件下收獲的HSC細(xì)胞純度顯著高于相同消化方法條件下的其他兩種灌注方式,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明,嚴(yán)格控制灌注液體的溫度、流速和灌注量(即控溫、控流、控時(shí))的方式分離HSC細(xì)胞,以及采用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液,獲得的HSC細(xì)胞數(shù)量更多,且HSC細(xì)胞存活率和純度也顯著提高。
2.4.1 流式細(xì)胞儀鑒定HSC細(xì)胞 HSC細(xì)胞具有自發(fā)熒光特性,能夠在405 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光下發(fā)出極易淬滅的藍(lán)色熒光。利用此自發(fā)熒光特性,檢測(cè)經(jīng)流式細(xì)胞儀分選收獲的HSC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)具有自發(fā)熒光特性的細(xì)胞所占比例為96.3%(圖4b);將分選的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察,可見(jiàn)HSC細(xì)胞(圖4c)。結(jié)果表明,通過(guò)前述方法分離的細(xì)胞為HSC細(xì)胞,并且具有較高細(xì)胞純度。
表1 不同灌注和消化方法對(duì)分離原代HSC細(xì)胞的收獲數(shù)量、存活率和純度的影響)
a:與相同消化方法不控制溫度/控流速比較,P<0.05;b:與相同消化方法下控溫/不控制流速比較,P<0.05;c:與同灌注方法下,單獨(dú)組比較,P<0.05
a:流式細(xì)胞分選后光鏡下觀察HSC細(xì)胞(×100);b:流式細(xì)胞儀測(cè)定自發(fā)熒光細(xì)胞比例;c:流式細(xì)胞分選后熒光顯微鏡下見(jiàn)HSC細(xì)胞(×100)
圖4流式細(xì)胞儀鑒定分離的原代HSC細(xì)胞
2.4.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色鑒定HSC細(xì)胞 如圖5所示,將HSC細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色,結(jié)果顯示,剛分離的HSC細(xì)胞Desmin表達(dá)呈陽(yáng)性,α-SMA表達(dá)呈陰性(圖5a、e)。傳代培養(yǎng)的HSC細(xì)胞,α-SMA和Desmin染色均呈陽(yáng)性(圖5b、c、e、f)。根據(jù)HSC細(xì)胞的表型特征,證實(shí)分離獲得的細(xì)胞為HSC細(xì)胞。
肝細(xì)胞由實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成。在各種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中,HSC細(xì)胞具有重要的生物學(xué)作用,與多種肝疾病特別是肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)[11-12]。HSC細(xì)胞是肝內(nèi)ECM的主要來(lái)源,對(duì)維持肝內(nèi)微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡有重要作用,因此在肝纖維化發(fā)生中起核心作用[13]。因此,肝纖維化研究通常以HSC細(xì)胞作為研究對(duì)象,探討其在肝纖維化發(fā)生中的作用機(jī)制,并尋找有效的防治方法。原代HSC細(xì)胞主要來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝,獲得足夠的高純度的HSC是順利開(kāi)展肝纖維化相關(guān)研究的重要保證。因此,建立穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟(jì)、可靠的HSC分離、培養(yǎng)技術(shù),對(duì)研究肝疾病特別是肝纖維化具有重要意義。
a:原代培養(yǎng)2 d α-SMA表達(dá)(×200);b:傳代培養(yǎng)第2代α-SMA的表達(dá)(×200);c:傳代培養(yǎng)第2代α-SMA的表達(dá)(×630);d:原代培養(yǎng)2 d Desmin表達(dá)(×200);e:傳代培養(yǎng)第2代Desmin的表達(dá)(×200);f:傳代培養(yǎng)第2代Desmin的表達(dá)(×630)
圖5免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示大鼠HSC細(xì)胞Desmin和α-SMA的表達(dá)
HSC細(xì)胞位于肝的Disse間隙內(nèi),在正常肝組織中,占肝細(xì)胞總數(shù)的5%~15%[14]。在正常肝內(nèi),HSC細(xì)胞被認(rèn)為處于靜息狀態(tài)。此時(shí)HSCs細(xì)胞胞質(zhì)富含維生素A和脂質(zhì)小滴,儲(chǔ)備著人體80%左右的維生素A,高表達(dá)GFAP、Desmin等蛋白。當(dāng)各種因素如病毒感染、炎癥因子等刺激下,HSC細(xì)胞可由靜息型轉(zhuǎn)化為活化型表型,且胞質(zhì)內(nèi)維生素A逐漸丟失,高表達(dá)α-SMA,同時(shí)其具有收縮和分泌膠原的特性,能產(chǎn)生大量ECM[15-17]。HSC細(xì)胞的分離在國(guó)外最早始于1876年[18],但其分離的細(xì)胞得率和純度均較低。我國(guó)到90年代開(kāi)始探索HSC的分離方法,但不同實(shí)驗(yàn)室采用的分離方法在純度、得率、存活率等方面均有不同程度的欠缺[7,10,19-21]。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期開(kāi)展肝相關(guān)疾病的研究,在既往大鼠原代HSC分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上,對(duì)灌注、消化、純化等多個(gè)操作步驟進(jìn)行了進(jìn)一步的探索和方法優(yōu)化,建立了穩(wěn)定、高效的HSC細(xì)胞分離方法,獲得了數(shù)量更多、活力更高、表型穩(wěn)定的HSC細(xì)胞,為肝相關(guān)疾病研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[22-23]。
為提高HSC細(xì)胞的收獲數(shù)量和純度,我們率先采用控溫、控流、控時(shí)的肝逆向兩步酶灌流法進(jìn)行原位組織消化;進(jìn)而用Percoll密度梯度離心分離純化HSC細(xì)胞;最后采用流式自熒光分選大大提高了細(xì)胞純度。本實(shí)驗(yàn)改良了大鼠HSC的分離方法,具體技術(shù)要點(diǎn)改進(jìn)如下:①采用控溫、控流、控時(shí)的肝逆向兩步酶灌流法大大提高了可重復(fù)性和細(xì)胞收獲數(shù)量。由于溫度對(duì)酶的活性影響較大,對(duì)灌注的液體溫度嚴(yán)格控制在37 ℃,可以大大減少溫度變化對(duì)酶活力的影響,維持酶的最大消化效果[7]。②在灌注的不同階段,對(duì)灌注液體速度進(jìn)行了嚴(yán)格控制。灌注EGTA液時(shí)要求壓力高、速度快,有利于快速?zèng)_洗出肝中的血液及其他雜質(zhì);而灌注膠原酶時(shí),需要酶液和肝充分接觸。因此,采用注射泵嚴(yán)格控制灌流速度,靈活控制酶與肝組織的接觸時(shí)間,通過(guò)多次探索確定了最優(yōu)化的灌注參數(shù),從而達(dá)到更好的消化效果。③嚴(yán)格控制灌注時(shí)間,防止過(guò)度消化,提高細(xì)胞活力。④密度梯度介質(zhì)的選擇及密度梯度離心體系的建立是純化HSC細(xì)胞、提高HSC細(xì)胞收獲數(shù)量和細(xì)胞純度的重要步驟。本研究選用Precoll密度離心液,與其他文獻(xiàn)中使用的密度梯度離心材料(如Optiprep[10]、Nycodenz[24]梯度離心分離液等)相比,Precoll具有相對(duì)更多的優(yōu)點(diǎn)。Precoll是一種被乙烯吡咯烷酮包被的硅膠顆粒,無(wú)毒性,能形成連續(xù)梯度和不連續(xù)的兩種梯度。梯度的穩(wěn)定性意味著可以實(shí)現(xiàn)混合細(xì)胞中不同細(xì)胞種類(lèi)的有效分層。而且Percoll很容易從被純化細(xì)胞中去除,不影響被分離細(xì)胞進(jìn)一步的研究[25]。另外,選擇水平低溫離心機(jī)及正確的離心轉(zhuǎn)數(shù)也非常重要,梯度離心時(shí)將離心機(jī)調(diào)節(jié)為無(wú)剎車(chē)狀態(tài)更加利于形成梯度離心后的細(xì)胞分層。⑤采用流式細(xì)胞儀鑒定和純化細(xì)胞,根據(jù)HSC細(xì)胞表型分選HSC細(xì)胞,可以有效提高HSC細(xì)胞純度。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠HSC細(xì)胞分離、純化、鑒定等方法進(jìn)行了改進(jìn),建立了較穩(wěn)定的大鼠HSC細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法,為進(jìn)一步開(kāi)展針對(duì)HSC細(xì)胞的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ),該分離培養(yǎng)方法值得推廣和應(yīng)用。
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