， ， ， ，乾勇，

[陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品安全研究中心，重慶市營(yíng)養(yǎng)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038]

肝是由多種細(xì)胞構(gòu)成，除了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞外，還存在大量的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，如肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)、各種免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等[1]。HSC細(xì)胞是肝內(nèi)重要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，不僅是人體維生素A的主要儲(chǔ)存場(chǎng)所，而且與多種肝疾病尤其是肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中，HSC細(xì)胞是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要來(lái)源，其細(xì)胞活化、分化和表型轉(zhuǎn)化對(duì)于肝纖維化疾病進(jìn)程、診斷和治療具有重要意義[4]。由于人體活體肝組織標(biāo)本來(lái)源有限，小動(dòng)物(特別是小鼠和大鼠)是HSC細(xì)胞的主要來(lái)源。但是因?yàn)楦渭?xì)胞種類(lèi)的多樣性、HSC細(xì)胞數(shù)量有限以及HSC細(xì)胞分離純化具有較高的技術(shù)要求，獲得足夠數(shù)量的具有良好細(xì)胞活力的HSC細(xì)胞成為開(kāi)展相關(guān)肝疾病研究的前提條件。大鼠是多種肝疾病研究的重要?jiǎng)游锬Ｐ?，本?shí)驗(yàn)室在既往大鼠原代HSC分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上[5-8]，對(duì)灌注、消化、純化等多個(gè)操作步驟進(jìn)行了進(jìn)一步的探索和方法優(yōu)化，建立了穩(wěn)定、高效的HSC細(xì)胞分離方法，獲得了數(shù)量更多、活力更高、表型穩(wěn)定的HSC細(xì)胞，為肝相關(guān)疾病研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠12只(12周齡)，購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量400～600 g，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 Ⅳ型膠原酶(Collagenase Ⅳ)、鏈蛋白酶(Pronase E)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DNA聚合酶Ⅰ(DNase Ⅰ)購(gòu)自美國(guó)Roche公司；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EGTA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Percoll密度梯度離心分離液購(gòu)自上海前程生物科技有限公司；HBSS緩沖液、臺(tái)盼藍(lán)染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；HEPES、胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum)為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；青霉素/鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自Gibco公司；兔抗鼠結(jié)蛋白(Desmin)單抗和兔抗鼠平滑肌蛋白(α-SMA)單抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 注射泵(蘭格恒流泵有限公司，LSP01-1A)、倒置相差顯微鏡(Olympus公司)、倒置熒光顯微鏡及影像采集系統(tǒng)(Olympus公司)、臺(tái)式低速水平離心機(jī)(Cence湘儀離心機(jī)儀器有限公司，L530)、流式細(xì)胞儀(BD FACSAria Ⅲ)、酶標(biāo)儀(美國(guó)，SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀)、CASY快速細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Roche公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配置 消化酶稀釋液：500 mL的HBSS緩沖液中添加HEPES 1 190 mg和CaCl2280 mg,混勻，4 ℃保存。EGTA液：500 mL不含Ca2+和Mg2+的HBSS液中添加EGTA 95 mg、HEPES 1 190 mg及1%體積的雙抗溶液，混勻，4 ℃保存。Pronase E液：稱(chēng)取28 mg Pronase E，溶解于70 mL消化酶稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用，用前40 ℃預(yù)熱。Collagenase Ⅳ液：稱(chēng)取40 mg Collagenase Ⅳ，溶解于80 mL消化酶稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用，用前40 ℃預(yù)熱。Pronase E/Collagenase Ⅳ肝組織體外消化液：稱(chēng)取25 mg Pronase E和25 mg Collagenase Ⅳ溶解于50 mL消化酶稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用。臨用前再加入0.5 mL DNase Ⅰ液混勻。GBSS-B離心稀釋液：CaCl2225 mg，葡萄糖 991 mg，KCl 370 mg，KH2PO430 mg，MgCl2210 mg，MgSO470 mg，Na2HPO475 mg，NaHCO3227 mg，NaCl 8 g加雙蒸水至1 L。過(guò)濾除菌待用，4 ℃保存。DNase Ⅰ液：稱(chēng)取20 mg DNase Ⅰ，加入10 mL GBSS-A溶液中，混勻溶液，分裝為1 mL/管，-20 ℃保存。密度梯度離心液：9 mL Percoll與1 mL 10倍濃度PBS混勻配制生理濃度的Percoll(Stock Isotonic Percoll)，使用前用完全培養(yǎng)基和PBS分別稀釋到40%和60%的濃度。HSC細(xì)胞完全培養(yǎng)基:高糖DMEM培養(yǎng)基中添加20%胎牛血清、10 mmol/L HEPES及1%雙抗。上述液體以pH計(jì)調(diào)節(jié)pH值為7.35～7.4后，0.22 μM除菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌。

1.2.2 肝原位灌注 5%水合氯醛麻醉大鼠(按體質(zhì)量8 μL/g)并固定在手術(shù)板上，75%乙醇消毒大鼠腹部?！肮ぁ毙未蜷_(kāi)腹腔，暴露下腔靜脈及肝。下腔靜脈插管，夾閉上腔靜脈，剪開(kāi)門(mén)靜脈。分別采用以下3種灌注方式灌入消化液，比較不同灌注方法對(duì)于肝細(xì)胞消化的效果：①?lài)?yán)格控制灌注液體的溫度、流速和總灌注量。利用注射泵從下腔靜脈灌注預(yù)熱到40 ℃的EGTA液，勻速灌注(20 mL/min)，至肝完全變白，總灌注體積約200 mL；再灌注預(yù)熱至37 ℃的Pronase E溶液約50 mL，勻速灌注(10 mL/min)；進(jìn)而灌注70 mL Collagenase Ⅳ溶液，勻速灌注(10 mL/min)，進(jìn)行肝原位消化。灌注過(guò)程中，需要嚴(yán)格控制灌注液的溫度、速度及灌注液總體積，并注意觀察是否有滲漏。②灌注液體的溫度為室溫，不預(yù)熱，其他操作相同[9]。③采用注射器人工灌注，未使用注射泵，灌注速度非勻速，其他操作相同[10]。

1.2.3 肝組織離體消化 將肝從大鼠腹腔分離，放置于100 mm培養(yǎng)皿中，分別加入5 mL的Pronase E/Collagenase Ⅳ消化液或Collagenase Ⅳ液消化肝組織，比較2種消化方法對(duì)HSC細(xì)胞分離效果的差異。用眼科剪剪碎肝并用彎頭吸管充分吹打分散肝細(xì)胞，將不同消化液消化后的肝細(xì)胞懸液分別轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中，平板搖床緩慢振蕩消化25 min。向錐形瓶?jī)?nèi)加入4 ℃預(yù)冷的完全培養(yǎng)基10 mL以終止消化，混勻后用70 nm篩網(wǎng)將細(xì)胞懸液過(guò)濾分裝于2個(gè)50 mL離心管中。

1.2.4 肝星狀細(xì)胞分離與純化 將上一步收集的肝細(xì)胞懸液于4 ℃、50×g低速離心5 min，收集上清液，并再以4 ℃、580×g離心10 min，小心吸棄大部分上清液，僅留約10 mL并加入120 μL的DNaseⅠ溶液，充分混勻。再加入GBSS-B溶液至50 mL，4 ℃、580×g離心10 min。棄上清，加入120 μL的DNaseⅠ溶液，混勻。取15 mL離心管依次緩慢加入60% Percoll 3 mL、40 % Percoll 3 mL及細(xì)胞懸液3 mL。將離心管放于低溫水平離心機(jī)中，1 380×g離心20 min。離心完畢后，可見(jiàn)離心管中部出現(xiàn)“戒指樣”乳白色環(huán)狀即為HSC細(xì)胞。小心吸取中間層HSC細(xì)胞至50 mL離心管，用GBSS-B溶液洗滌細(xì)胞。4 ℃、580×g離心10 min，加入完全培養(yǎng)基重懸。細(xì)胞分離流程如圖1所示。采用CASY快速細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定每只大鼠收獲的HSC細(xì)胞數(shù)量，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

a:下腔靜脈插管;b:灌注前準(zhǔn)備;c:原位消化;d:分離肝臟;e:體外消化;f:離心和洗滌細(xì)胞;g:密度梯度制備及離心;h:吸取中間層HSC;i:離心洗滌細(xì)胞

圖1大鼠肝星狀細(xì)胞分離示意圖

1.2.5 原代細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 HSC細(xì)胞原代培養(yǎng)：用含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞以4×105/mL接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37 ℃、100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。36～48 h后更換培養(yǎng)基，改用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，以后每2 d更換1次培養(yǎng)液。倒置相差顯微鏡觀察原代HSC細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)：吸取40 μL細(xì)胞懸液，加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶10 μL，混勻后倒置顯微鏡下未著色者為活細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞存活率=(光鏡下一個(gè)視野中活細(xì)胞數(shù)/視野中細(xì)胞總數(shù))×100%。隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞存活率并取平均值。CCK-8實(shí)驗(yàn)：原代HSC細(xì)胞以0.25%胰酶消化液消化后，用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液至5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，每天按照每孔10 μL加入CCK-8溶液，孵育1 h，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm測(cè)定各孔吸光度值，根據(jù)測(cè)定結(jié)果制做HSC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 細(xì)胞鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度：取剛分離的原代HSC細(xì)胞，離心后用1 mL PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為107/mL，于流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)，并通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定HSC細(xì)胞純度，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞純度：原代HSC細(xì)胞以0.25%胰酶消化液消化后，用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液至5×104/mL，接種于放有爬片的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，用固定液固定10 min后，再用PBS漂洗3次，羊血清封閉30 min；分別加入抗-Desmin或抗-α-SMA一抗工作液，4 ℃孵育過(guò)夜。然后，以PBS輕洗細(xì)胞3次，每次5 min后，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗工作液，室溫孵育60 min。PBS輕洗細(xì)胞3次，每次5 min。加入細(xì)胞核染液DAPI，室溫孵育5 min；PBS輕洗細(xì)胞3次，每次5 min，甘油封片。置于熒光顯微鏡下觀察、照相并分析HSC細(xì)胞內(nèi)Desmin和α-SMA的表達(dá)情況。根據(jù)Desmin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算細(xì)胞純度，細(xì)胞純度=(結(jié)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù))×100%，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HSC細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

置于倒置相差顯微鏡下，觀察到新分離的HSC細(xì)胞呈圓形，折光性強(qiáng)，懸浮于培養(yǎng)液中(圖2a)。24 h后大部分細(xì)胞已貼壁，呈扁圓型，內(nèi)含光亮的脂滴，少量細(xì)胞已開(kāi)始伸展(圖2b)；培養(yǎng)7 d后，HSC細(xì)胞已充分展開(kāi)，體積明顯增大，細(xì)胞呈典型的星形或多邊形；細(xì)胞內(nèi)顆粒明顯減少，細(xì)胞逐漸融合，增殖速度加快，并呈局灶性生長(zhǎng)，呈完全活化狀態(tài)(圖2c)；傳代后，HSC細(xì)胞體積逐漸變大，成纖維化發(fā)展，單層生長(zhǎng)，鋪滿瓶底，細(xì)胞呈典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(圖2d)。HSC細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，其形態(tài)發(fā)生明顯改變，即由靜息狀態(tài)向活化的肌成纖維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化。

2.2 HSC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果制作HSC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖3)，結(jié)果表明，在接種后至第3天，細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢，逐漸貼附于培養(yǎng)瓶底并伸展開(kāi)；從第3天起，細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)量迅速增加；至第9天，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期；至第11天后細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減慢。

a：剛分離的原代HSC細(xì)胞；b：原代HSC細(xì)胞培養(yǎng)24 h；c：原代HSC細(xì)胞培養(yǎng)7 d；d：原代HSC細(xì)胞傳代培養(yǎng)第1代

圖2倒置相差顯微鏡觀察原代培養(yǎng)的大鼠HSC細(xì)胞(×200)

圖3 原代HSC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 不同灌注和分離方法的比較

采用3種不同灌注方法分離肝HSC細(xì)胞并比較細(xì)胞收獲數(shù)量，結(jié)果顯示，采用嚴(yán)格控制灌注液體的溫度和流速，分離得到的大鼠HSC細(xì)胞數(shù)量最多，采用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液(聯(lián)合組)每只大鼠約收獲(2.1±0.2)×107個(gè)，而采用Collagenase Ⅳ消化液(單獨(dú)組)每只大鼠約收獲(1.7±0.2)×107個(gè)，均分別顯著高于采用相同消化方法條件下的其他兩種灌注方法(不控制溫度/控流、控溫/不控制流速)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。同時(shí)，在控溫/控流速條件下，使用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液和單獨(dú)使用Collagenase Ⅳ消化液相比，前者收獲的HSC細(xì)胞更多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

分離的HSC細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，結(jié)果顯示，采用控溫/控流速的灌注方法，在使用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液條件下獲得的HSC細(xì)胞存活率和使用Collagenase Ⅳ消化液條件下獲得的HSC細(xì)胞存活率，均分別顯著高于采用相同消化方法條件下的其他兩種灌注方式，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)新鮮分離的HSC細(xì)胞在熒光顯微鏡下(405 nm)能自發(fā)出藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)(圖4a)，比較不同灌注和消化方法得到的細(xì)胞純度的差異。結(jié)果顯示：采用控溫/控流速的灌注方法，在使用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液條件下收獲的HSC細(xì)胞純度顯著高于相同消化方法條件下的其他兩種灌注方式，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，嚴(yán)格控制灌注液體的溫度、流速和灌注量(即控溫、控流、控時(shí))的方式分離HSC細(xì)胞，以及采用Pronase E/Collagenase Ⅳ聯(lián)合消化液，獲得的HSC細(xì)胞數(shù)量更多，且HSC細(xì)胞存活率和純度也顯著提高。

2.4 HSC細(xì)胞鑒定

2.4.1 流式細(xì)胞儀鑒定HSC細(xì)胞 HSC細(xì)胞具有自發(fā)熒光特性，能夠在405 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光下發(fā)出極易淬滅的藍(lán)色熒光。利用此自發(fā)熒光特性，檢測(cè)經(jīng)流式細(xì)胞儀分選收獲的HSC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)具有自發(fā)熒光特性的細(xì)胞所占比例為96.3%(圖4b)；將分選的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)HSC細(xì)胞(圖4c)。結(jié)果表明，通過(guò)前述方法分離的細(xì)胞為HSC細(xì)胞，并且具有較高細(xì)胞純度。

表1 不同灌注和消化方法對(duì)分離原代HSC細(xì)胞的收獲數(shù)量、存活率和純度的影響)

a：與相同消化方法不控制溫度/控流速比較，P<0.05；b：與相同消化方法下控溫/不控制流速比較，P<0.05；c：與同灌注方法下，單獨(dú)組比較，P<0.05

a：流式細(xì)胞分選后光鏡下觀察HSC細(xì)胞(×100)；b:流式細(xì)胞儀測(cè)定自發(fā)熒光細(xì)胞比例；c：流式細(xì)胞分選后熒光顯微鏡下見(jiàn)HSC細(xì)胞(×100)

圖4流式細(xì)胞儀鑒定分離的原代HSC細(xì)胞

2.4.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色鑒定HSC細(xì)胞 如圖5所示，將HSC細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示，剛分離的HSC細(xì)胞Desmin表達(dá)呈陽(yáng)性，α-SMA表達(dá)呈陰性(圖5a、e)。傳代培養(yǎng)的HSC細(xì)胞，α-SMA和Desmin染色均呈陽(yáng)性(圖5b、c、e、f)。根據(jù)HSC細(xì)胞的表型特征，證實(shí)分離獲得的細(xì)胞為HSC細(xì)胞。

3 討論

肝細(xì)胞由實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成。在各種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，HSC細(xì)胞具有重要的生物學(xué)作用，與多種肝疾病特別是肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)[11-12]。HSC細(xì)胞是肝內(nèi)ECM的主要來(lái)源，對(duì)維持肝內(nèi)微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡有重要作用，因此在肝纖維化發(fā)生中起核心作用[13]。因此，肝纖維化研究通常以HSC細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討其在肝纖維化發(fā)生中的作用機(jī)制，并尋找有效的防治方法。原代HSC細(xì)胞主要來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝，獲得足夠的高純度的HSC是順利開(kāi)展肝纖維化相關(guān)研究的重要保證。因此，建立穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟(jì)、可靠的HSC分離、培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)研究肝疾病特別是肝纖維化具有重要意義。

a:原代培養(yǎng)2 d α-SMA表達(dá)(×200);b:傳代培養(yǎng)第2代α-SMA的表達(dá)(×200);c:傳代培養(yǎng)第2代α-SMA的表達(dá)(×630);d:原代培養(yǎng)2 d Desmin表達(dá)(×200);e:傳代培養(yǎng)第2代Desmin的表達(dá)(×200);f:傳代培養(yǎng)第2代Desmin的表達(dá)(×630)

圖5免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示大鼠HSC細(xì)胞Desmin和α-SMA的表達(dá)

HSC細(xì)胞位于肝的Disse間隙內(nèi)，在正常肝組織中，占肝細(xì)胞總數(shù)的5%～15%[14]。在正常肝內(nèi)，HSC細(xì)胞被認(rèn)為處于靜息狀態(tài)。此時(shí)HSCs細(xì)胞胞質(zhì)富含維生素A和脂質(zhì)小滴，儲(chǔ)備著人體80%左右的維生素A，高表達(dá)GFAP、Desmin等蛋白。當(dāng)各種因素如病毒感染、炎癥因子等刺激下，HSC細(xì)胞可由靜息型轉(zhuǎn)化為活化型表型，且胞質(zhì)內(nèi)維生素A逐漸丟失，高表達(dá)α-SMA，同時(shí)其具有收縮和分泌膠原的特性，能產(chǎn)生大量ECM[15-17]。HSC細(xì)胞的分離在國(guó)外最早始于1876年[18]，但其分離的細(xì)胞得率和純度均較低。我國(guó)到90年代開(kāi)始探索HSC的分離方法，但不同實(shí)驗(yàn)室采用的分離方法在純度、得率、存活率等方面均有不同程度的欠缺[7,10,19-21]。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期開(kāi)展肝相關(guān)疾病的研究，在既往大鼠原代HSC分離培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)灌注、消化、純化等多個(gè)操作步驟進(jìn)行了進(jìn)一步的探索和方法優(yōu)化，建立了穩(wěn)定、高效的HSC細(xì)胞分離方法，獲得了數(shù)量更多、活力更高、表型穩(wěn)定的HSC細(xì)胞，為肝相關(guān)疾病研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[22-23]。

為提高HSC細(xì)胞的收獲數(shù)量和純度，我們率先采用控溫、控流、控時(shí)的肝逆向兩步酶灌流法進(jìn)行原位組織消化；進(jìn)而用Percoll密度梯度離心分離純化HSC細(xì)胞；最后采用流式自熒光分選大大提高了細(xì)胞純度。本實(shí)驗(yàn)改良了大鼠HSC的分離方法，具體技術(shù)要點(diǎn)改進(jìn)如下：①采用控溫、控流、控時(shí)的肝逆向兩步酶灌流法大大提高了可重復(fù)性和細(xì)胞收獲數(shù)量。由于溫度對(duì)酶的活性影響較大，對(duì)灌注的液體溫度嚴(yán)格控制在37 ℃，可以大大減少溫度變化對(duì)酶活力的影響，維持酶的最大消化效果[7]。②在灌注的不同階段，對(duì)灌注液體速度進(jìn)行了嚴(yán)格控制。灌注EGTA液時(shí)要求壓力高、速度快，有利于快速?zèng)_洗出肝中的血液及其他雜質(zhì)；而灌注膠原酶時(shí)，需要酶液和肝充分接觸。因此，采用注射泵嚴(yán)格控制灌流速度，靈活控制酶與肝組織的接觸時(shí)間，通過(guò)多次探索確定了最優(yōu)化的灌注參數(shù)，從而達(dá)到更好的消化效果。③嚴(yán)格控制灌注時(shí)間，防止過(guò)度消化，提高細(xì)胞活力。④密度梯度介質(zhì)的選擇及密度梯度離心體系的建立是純化HSC細(xì)胞、提高HSC細(xì)胞收獲數(shù)量和細(xì)胞純度的重要步驟。本研究選用Precoll密度離心液，與其他文獻(xiàn)中使用的密度梯度離心材料(如Optiprep[10]、Nycodenz[24]梯度離心分離液等)相比，Precoll具有相對(duì)更多的優(yōu)點(diǎn)。Precoll是一種被乙烯吡咯烷酮包被的硅膠顆粒，無(wú)毒性，能形成連續(xù)梯度和不連續(xù)的兩種梯度。梯度的穩(wěn)定性意味著可以實(shí)現(xiàn)混合細(xì)胞中不同細(xì)胞種類(lèi)的有效分層。而且Percoll很容易從被純化細(xì)胞中去除，不影響被分離細(xì)胞進(jìn)一步的研究[25]。另外，選擇水平低溫離心機(jī)及正確的離心轉(zhuǎn)數(shù)也非常重要，梯度離心時(shí)將離心機(jī)調(diào)節(jié)為無(wú)剎車(chē)狀態(tài)更加利于形成梯度離心后的細(xì)胞分層。⑤采用流式細(xì)胞儀鑒定和純化細(xì)胞，根據(jù)HSC細(xì)胞表型分選HSC細(xì)胞，可以有效提高HSC細(xì)胞純度。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠HSC細(xì)胞分離、純化、鑒定等方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了較穩(wěn)定的大鼠HSC細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步開(kāi)展針對(duì)HSC細(xì)胞的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，該分離培養(yǎng)方法值得推廣和應(yīng)用。

[1] 俞富祥,蘇龍豐,季世強(qiáng),等.改良小鼠肝星狀細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及性質(zhì)鑒定[J].肝膽胰外科雜志,2010,22(6):457-459.doi:10.396/j.issn.1007-1954.2010.06.006.

[2] Tang G,Weng Z,Song J,et al.Reversal effect of Jagged1 signaling inhibition on CCl4-induced hepatic fibrosis in rats[J].Oncotarget,2017,8(37):60778-60788.doi.10.18632/oncotarget.18484.

[3] Puche JE,Saiman Y,Friedman SL.Hepatic stellate cells and liver fibrosis[J].Compr Physiol,2013,3(4):1473-1492.doi.10.1002/cphy.c120035.

[4] Zhang CY,Yuan WG,He P,et al.Liver fibrosis and hepatic stellate cells:Etiology,pathological hallmarks and therapeutic targets[J].World J Gastroenterol,2016,22(48):10512-10522.doi.10.3748/wjg.v22.i48.10512.

[5] 李玉蓮,宋正己,范 紅,等.建立一種改良方法分離大鼠肝星狀細(xì)胞[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,33(6):18-20.doi:10.396/j.issn.1003-4706.2012.06.005.

[6] 賽 雪,何 興,潘衛(wèi)慶.日本血吸蟲(chóng)感染小鼠肝星狀細(xì)胞的分離[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2013,13(8):915-917.doi:10.13604/j.cnki.46-1064/r.2013.08.031.

[7] Mederacke I,Dapito DH,Affò S,et al.High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers[J].Nature Protocols,2015,10(2):305-315.doi.10.1038/nprot.2015.017.

[8] Maschmeyer P,Flach M,Winau F.Seven steps to stellate cells[J].J Vis Exp,2011(51):e2710.doi.10.3791/2710.

[9] 蔡偉祥,方建鳳,莊 偉,等.分離、鑒定與培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,46(9):638-643.doi:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.09.004.

[10] 戴春蕾,陳少隆,陳黎黎,等.Optiprep梯度離心法提取大鼠肝星狀細(xì)胞的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2013,42(1):142-144.doi:10.3969/j.issn.1673-548x.2013.01.044.

[11] Moran-Salvador E,Mann J.Epigenetics and Liver Fibrosis[J].Cell Mol Gastroenterol Hepatol,2017,4(1):125-134.doi.10.1016/j.jcmgh.2017.04.007.

[12] 畢曉娟,張傳山,李 亮,等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1刺激改良培養(yǎng)小鼠原代肝星狀細(xì)胞的活化[J].中國(guó)組織工程研究,2015,19(51):8234-8240.

[13] Huang Y,Deng X,Liang J.Modulation of hepatic stellate cells and reversibility of hepatic fibrosis[J].Exp Cell Res,2017,352(2):420-426.doi.10.1016/j.yexcr.2017.02.038.

[14] 李 洋,蔡雙明,張莉莉,等.大鼠原代肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的同步分離與培養(yǎng)[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,34(4):532-537.doi:10.3969/j.issn.1673-4254.2014.04.020.

[15] de Oliveira DSB,Ramos LF,Moraes K.Molecular interplays in hepatic stellate cells:apoptosis,senescence,and phenotype reversion as cellular connections that modulate liver fibrosis[J].Cell Biol Int,2017,9(41):946-959.doi.10.1002/cbin.10790.

[16] Li M,Hong W,Hao C,et al.SIRT1 antagonizes liver fibrosis by blocking hepatic stellate cell activation in mice[J].FASEB J,2017,10(31):1-12.doi.10.1096/fj.201700612R.

[17] Senoo H,Mezaki Y,Fujiwara M.The stellate cell system(vitamin A-storing cell system)[J].Anat Sci Int,2017,92(4):387-455.doi.10.1007/s12565-017-0395-9.

[18] Friedman SL,Roll FJ.Isolation and culture of hepatic lipocytes,Kupffer cells,and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan[J].Anal Biochem,1987,161(1):207-218.

[19] Panebianco C,Oben JA,Vinciguerra M,et al.Senescence in hepatic stellate cells as a mechanism of liver fibrosis reversal:a putative synergy between retinoic acid and PPAR-gamma signalings[J].Clin Exp Med,2017,17(3):269-280.doi:10.1007/s10238-016-0438-x.

[20] 李海媛,王 雪,時(shí)永全,等.建立同時(shí)分離培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞的技術(shù)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,14(16):3033-3037.doi:10.1324/j.cnki.pmb.2014.16.009.

[21] 劉 幸,田 甜,余 蕾,等.辛二酰苯胺異羥肟酸誘導(dǎo)大鼠原代肝星狀細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)病理生理雜志,2017,33(5):913-918.

[22] Shi L,Zhang T,Liang X,et al.Dihydromyricetin improves skeletal muscle insulin resistance by inducing autophagy via the AMPK signaling pathway[J].Mol Cell Endocrinol,2015,409:92-102.doi.10.1016/j.mce.2015.03.009.

[23] Shi L,Zhang T,Zhou Y,et al.Dihydromyricetin improves skeletal muscle insulin sensitivity by inducing autophagy via the AMPK-PGC-1alpha-Sirt3 signaling pathway[J].Endocrine,2015,50(2):378-389.doi:10.1007/s12020-015-0599-5.

[24] Zhu YJ,Hu XL,Men RT,et al.Role of macrophage migration inhibitory factor in hepatic stellate cells activation[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2013,44(3):352-356.

[25] 朱永軍,胡曉琳,門(mén)若庭,等.巨噬細(xì)胞游走抑制因子參與肝星狀細(xì)胞活化的實(shí)驗(yàn)研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,44(3):352-356.